circRNA与mRNA互作

韩国科学技术院Yoon Ki Kim研究团队揭示了circRNA可通过与mRNA的3′ UTR相互作用，将其携带的外显子连接复合体（EJC）定位在mRNA的3′ UTR附近，从而靶向调控无义介导的mRNA降解(NMD)机制。人工设计的circRNA，可靶向下调mRNA水平，为circRNA在基因沉默和疾病治疗中的潜在应用开辟了广阔前景。^[11]
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肿瘤疫苗类型包括肽/蛋白、树突状细胞(DC)和核酸(包括DNA和RNA疫苗)。其中RNA疫苗可在细胞质内快速表达抗原，从而导致强大的免疫激活，还可避免基因组整合和T细胞耐受性相关风险。加之circRNA的独特优势，可成为极具前景的肿瘤疫苗载体。

斯坦福大学的张元豪和Wender研究团队利用circRNA编码卵清蛋白 (OVA)^[27]，多伦多大学李博文团队利用circRNA编码IL-12^[28]、福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙/赵必星团队利用circRNA编码新抗原PTPN2多肽片段^[29]，结果发现这些circRNA肿瘤疫苗均可在模型体内诱导强烈的抗肿瘤免疫反应，且能强效、安全、稳定抑制肿瘤生长，甚至清除肿瘤，效果显著优于线性mRNA，且无明显副作用。

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中山大学附属第一医院张弩团队联合吉赛生物团队开发表达lncRNA编码肽肿瘤抗原的疫苗circH19-vac，可触发针对胶质母细胞瘤的强效细胞毒性T细胞反应并抑制肿瘤生长。^[30]

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circRNA还有望成为优越的肿瘤抗原载体，开发有效的DC疫苗。吉林大学张海红团队开发编码肿瘤抗原FAPα和survivin的circRNA DC疫苗，可显著抑制肿瘤生长，与吉西他滨药物进行联合治疗，显著延长了胰腺癌小鼠的存活率。^[31]

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图4 circRNA疫苗激活免疫反应。^[32]

CAR-T疗法

附：2020年国家自然科学基金杰出青年基金资助名单：（名单来自基金委主页，内容稍有调整）

1. 2019年circRNA研究总体情况概览：

1.1 circRNA相关发表文章情况汇总

2019年circRNA研究论文呈现量质齐升的良好态势，发表论文总数量较2018年有较大的增长，尤其是影响因子大于10 的文章数目更是有了巨大的增长。发表文章的通讯作者单位情况来看，我国是circRNA研究的绝对主力阵地，但2019年美国，德国，加拿大等传统生物医学研究强国也陆续发表了一些有重要影响的研究论文，说明circRNA的研究已经慢慢被国际学术界接受和认可，也预示着将来circRNA会有更多重要的研究成果。

图1 2016 ~ 2019年circRNA相关发表文章信息汇总

1.2 circRNA相关国家自然科学基金情况汇总

2019年circRNA研究领域共有257个项目获批，其中包括杰出青年基金项目1项，重点项目2项，创新研究群体项目1项，面上项目113项，地区基金项目24项，青年科学基金项目116项。

表1 2016 ~ 2019年国家自然科学基金circRNA相关项目信息汇总

2019年获批项目绝大部分的内容是针对特定circRNA的功能研究，大部分都给出了明确的机制和通路，表明circRNA的功能研究已进入全新的阶段。总体呈现的一些特征如下：

（1） 学科方向方面，医学领域依然具有压倒性优势，动物学、植物学以及生物信息学方向也有获批的项目。但生物化学和分子生物学，细胞生物学，遗传学，干细胞与再生医学等学科方向的项目偏少。可能与circRNA基础生命科学问题的研究难度有一定关系。

（2）研究内容更加明确和具体。2019年获批的项目从题目中不难看出，大部分都是基于某个特定circRNA分子和特定的通路和机制来写的，说明申请者已对相关分子的功能和作用机制有了较详细的认知。这也说明circRNA的功能和机制的研究已经越来越细致和深入。

（3）circRNA的功能机制模型和通路呈现多样化趋势。2019年获批的项目中除了传统的竞争性结合miRNA功能模式，circRNA直接翻译多肽，与蛋白的相互作用以及circRNA的m⁶A修饰等功能模型相关的项目越来越多。此外，近几年热度较高的分子细胞生物学机制和通路也在今年获批的cirRNA项目中多次出现，包括m⁶A修饰，外泌体，细胞焦亡，相分离，铁死亡等等。说明circRNA的研究正越来越融入分子细胞生物学研究中。

2. circRNA基本生命科学问题研究进展

circRNA早在1976年就发现了，但真正的研究热潮是从2012年开始的，主要是伴随着高通量测序技术的广泛应用而逐渐兴起的。目前人类组织来源的circRNA已经发现了几十万种，但关于它们的表达机制，功能作用方式，修饰及其调控方式，二级/高级结构，降解机制等基本生命科学问题的研究和认识还在持续进展中。2019年关于circRNA的生成机制，m⁶A修饰，翻译产物，互作分子，降解机制方面有一些进展，有关circRNA的特殊生物学功能机制研究也有一些报道，现分别汇总如下：

2.1 circRNA生成机制研究进展

2019年关于circRNA生成和表达机制有一些进展，包括通过解析酵母剪切体E复合体的结构，揭示了反向剪切的结构生物学机制，发现了几种能调控circRNA生成的特殊RNA结合蛋白，首次报道人类线粒体来源circRNA等等。

酵母剪切体E复合体结构揭示circRNA形成机制

2019年9月6日，Nature杂志发表了一项酵母剪切体E复合体的结构生物学研究成果，揭示了E复合体的组装机制，首次从结构生物学角度证明了“Intro-definition”和“Exon- definition”两种E复合体组装的机制均可存在。基于这一结构作者分析了长外显子circRNA的形成机制，外显子足够长的情况下，EDC复合体可以介导pre-mRNA内部反向剪切，最终形成circRNA。论文的通讯作者是美国科罗拉多大学安舒茨医学校区的Rui Zhao和加州大学洛杉矶分校的Z. Hong Zhou（[1]）。

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图2 剪切体E复合体介导pre-mRNA和circRNA剪切的机制 （[1]）

调控circRNA生成的RNA结合蛋白

RNA结合蛋白（RBP）是调控circRNA生成的重要因素，很可能是circRNA组织/疾病特异性表达的主要机制。人们一直在不断探索和发现可调控circRNA生成的RBP蛋白， 2019年共有5篇文章涉及到RBP调控circRNA生成的研究，具体信息汇总如下：

表5 2019年报道调控circRNA生成的RBP

哺乳动物的散在重复元件（MIR）调控 circRNA的生成

2019年6月4日，知名预印本杂志BioRxiv发表一项circRNA生成机制有关的研究成果，报道发现CDR1as也可以由哺乳动物的散在重复元件（Mammalian-Wide Interspersed Repeats，MIR）介导生成（[2]）。文章的通讯作者是日本藤田健康大学的Akila Mayeda。

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图3 MIR调控CDR1as 的生成 （[2]）

2.2 特殊类型circRNA的发现

常见的circRNA主要由mRNA的外显子通过反向剪切形成，但还有一些circRNA来源比较特殊，比如融合基因形成的circRNA等等。2019年陆续报道了一些新的circRNA形式，包括融合基因来源的circRNA，转录通读型circRNA，线粒体DNA来源circRNA。

融合基因来源circRNA研究

融合基因是很多肿瘤的驱动因素，如白血病，肺癌等等。早在2016年就曾报道融合基因来源的circRNA具有致癌作用（推荐阅读：cell杂志：融合环状RNA文献解读）。四川大学彭勇教授2018年也曾报道肺癌中EML4-ALK融合基因来源的circRNA（F-circrEA）可以作为肺癌诊断标志物（推荐阅读：新型融合基因来源环形RNA可能作为肺癌诊断标志物）。2019年，彭勇教授再次发表文章报道融合基因来源circRNA，报道SLC34A2-ROS1来源的circRNA（F-circrSR1和F-circrSR2）可促进肺癌侵袭（[3]），相关工作发表于5月24日的Molecular Cancer杂志。

图4 SLC34A2-ROS1融合基因来源circRNA鉴定 （[3]）

转录通读型circRNA

常见的基因转录活动在基因全序列被完全转录完成后终止，但在一些特殊情况下，转录过程还会继续往下进行，如果下游刚好在DNA的同一链上也有个基因，就会产生同一个转录本携带两个基因的形式，这就是转录通读（Read Through）。2017年就曾有文章报道转录通读过程与circRNA的形成有关（推荐阅读：重磅！Molecular Cell杂志发表circRNA形成机制的重要文章），当时发现干扰调控转录终止的基因可有助于转录通读产物的生成，并且可促进下游基因来源circRNA的生成（[4]）。

2019年2月7日的一篇Cell文章在全外显子组芯片数据中挖掘得到了大量的circRNA，其中也有转录通读型的circRNA产物（rt-circRNA）。文章分析了超过2000例不同组织来源的人类肿瘤标本，二十多种肿瘤中circRNA的总体表达情况，并汇总形成了MiOncoCirc数据库（[5]）。文章通讯作者为密歇根大学Alexey I. Nesvizhskii和Arul M. Chinnaiyan。

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图5 人类肿瘤中存在转录通读型circRNA（[5]）

首次报道线粒体编码基因来源circRNA

2019年6月12日，预印本杂志BioRxiv发表了中国科学技术大学单革教授的一项研究成果，报道发现人与小鼠线粒体来源的circRNA（mecciRNAs）。这是首次报道发现哺乳动物线粒体来源的circRNA分子，丰富了circRNA的来源和认识（[6]）。

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图6 mecciRNAs鉴定 （[6]）

2.3 circRNA的m⁶A修饰研究进展

转录后修饰是RNA功能调控的一个维度，以m⁶A为代表的RNA修饰方式和调控机制的研究是近期RNA研究领域的重要热点方向之一。早在2016年就曾报道发现了circRNA存在特异性的m⁶A修饰（推荐阅读：重大发现：circRNA存在细胞特异性的m⁶A修饰！），并且介导了circRNA的翻译（推荐阅读：重磅：m⁶A修饰促进环状RNA的翻译）。

2019年circRNA的m⁶A修饰取得了不少进展，包括m⁶A修饰相关的circRNA降解机制，m⁶A修饰介导的circRNA出核现象，m⁶A修饰在细胞中区分内源和外源circRNA的机制等等。circRNA降解在下面有专门的内容介绍，细胞区分内源和外源circRNA的机制也在后面有专门的探讨，因此本部分主要介绍其他的内容：

m⁶A修饰介导circRNA出核

2019年10月16日，Nature Communications杂志在线发表了发表了一项circRNA m6A修饰的文章，报道发现m⁶A修饰的circNSUN2可结合YTHDC1并促进出核，进一步结合IGF2BP2促进HMGA2 mRNA的稳定，最终促进大肠癌的肝转移增强。文章的通讯作者是中山大学附属肿瘤医院的谢丹教授，徐瑞华教授和Wang Fengwei。本文从小样本临床标本的分析入手，找到CRC肝转移相关的circRNA分子，然后基于RNA Pull-down分析，发现了circNSUN2的相互作用蛋白YTHDC1和IGF2BP2，进而从干扰circNSUN2前后转录组差异分析结合作者所发现的现象找到HMGA2 mRNA是circNSUN2促进CRC肝转移的介导分子（[7]）。

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图7 m⁶A修饰促进circNSUN2出核介导CRC肝转移 （[7]）

大鼠缺氧性肺动脉高压模型中m⁶A修饰研究

2019年5月1日，预印本杂志BioRxiv发表了浙江大学医学院应可净和章锐锋为通讯作者的文章，报道大鼠缺氧性肺动脉高压（HPH）模型中。circRNA m⁶A修饰状态的研究结果（[8]）。文章的结果表明一些circRNA的m⁶A修饰会伴随缺氧条件而发生修饰或去修饰的改变，说明m⁶A修饰与缺氧条件有密切的关系。

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图8 大鼠HPH 模型中circRNA m⁶A修饰分析（[8]）

2.4 circRNA翻译研究进展

自2017年首次报道哺乳动物内源circRNA可以翻译多肽/蛋白以来，有关circRNA翻译的研究就一直备受关注。2019年circRNA的翻译研究也取得了一些进展，包括心脏翻译组学的研究中发现了可翻译的circRNA分子，Akt3，β-catenin等基因来源circRNA的翻译产物鉴定和研究。

心脏翻译组学研究发现可翻译circRNA

2019年5月30日，Cell杂志以Resource形式发表了一项心脏翻译组学的研究工作，系统分析了心脏组织中能被翻译的RNA分子，心脏中RNA翻译的规律和机制，研究中发现了一些非编码RNA来源的翻译产物，其中包括circRNA。文章的通讯作者是德国柏林Max Delbruck分子医学中心的Sebastiaan van Heesch和Norbert Hubner。本文作者分析了80例人心脏组织的翻译组学（其中65例扩张型心肌病，15例健康对照），发现了心脏组织特异的蛋白翻译机制。在捕获的可翻译的RNA分子中发现了169种lncRNA，40种circRNA，进一步佐证了非编码RNA，包括circRNA能被翻译的事实（[9]）。

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图9 心脏翻译组学研究 （[9]）

2019年还有另外一篇翻译组学的研究工作发现了一些可能翻译的circRNA分子。12月20日，cells杂志发表了一项在分化型神经母细胞瘤中进行的circRNA表达谱分析，作者也进行了核糖体测序分析，在Ribo-seq的结果中共发现了173种可能被翻译的circRNA分子（[10]）。

Circ-AKT3编码174aa的多肽

2019年8月30日，Molecular Cancer杂志在线发表了中山大学附属第一医院张弩副教授的最新研究成果，报道发现AKT3来源的一个circRNA（Circ-AKT3）可编码一种174aa的多肽（AKT3-174aa）。在GBM细胞中过表达AKT3-174aa可抑制细胞增殖，抗辐射和体内致瘤能力，而敲低circ-AKT3后则增强了星形细胞瘤细胞的恶性表型。机制研究表明，AKT3-174aa与磷酸化PDK1竞争性相互作用，减少AKT-thr308磷酸化，并在调节PI3K/AKT信号强度中起负调节作用（[11]）。

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图10 Circ-AKT3编码一个174aa的蛋白（[11]）

circPPP1R12A翻译多肽通过Hippo-YAP 通路调控结肠癌侵袭

2019年3月29日，Molecular Cancer杂志在线发表了苏州大学附属第三医院蒋敬庭为通讯作者的文章，报道发现circPPP1R12A在结肠癌中显著高表达，进一步的研究发现circPPP1R12A可以编码一种73aa的小肽（circPPP1R12A-73aa），circPPP1R12A-73aa可以通过Hippo-YAP 通路参与结肠癌的转移侵袭（[12]）。

图11 circPPP1R12A编码一种73aa的小肽 （[12]）

β-catenin来源circRNA翻译产物通过激活Wnt途径促进肝癌细胞生长

2019年4月26日，Genome Biology杂志发表了一项circRNA翻译产物的研究工作，报道发现circβ-catenin可翻译一种370aa的蛋白，可通过竞争性抑制GSK3β，阻断GSK3β对全长β-catenin的磷酸化和随后的泛素化降解（[13]）。文章的通讯作者为广州中医药大学第一附属医院的Jin-Fang Zhang、南方医科大学药学院的Wei-Ming Fu和中山大学附属第三医院的张琪。

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图12 circ β-catenin翻译新蛋白鉴定 （[13]）

HPV编码circRNA翻译产物助纣为虐

2019年5月24日，Nature communications在线发表了一项HPV来源circRNA翻译产物致病性作用机制的研究。文章发现HPV16来源的circE7携带了完整的E7基因ORF序列，并证明circE7可翻译出对应的蛋白，可促进子宫颈癌细胞发生转化（[14]）。文章的通讯作者是来自美国德克萨斯大学西南医学中心皮肤科的Richard C. Wang和芝加哥西北大学Feinberg医学院微生物免疫学系的Laimonis Laimins。

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图13 HPV16来源circE7编码产物鉴定 （[14]）

circRNA翻译起始机制研究

2019年9月25日，预印本杂志BioRxiv发表了中科院计算生物学研究所王泽峰教授为通讯作者的一项研究工作，通过设计随机序列后筛选的技术，分析了circRNA中IRES-like元件。共筛选到97种可以在circRNA中驱动翻译的富含AU的IRES-like元件（[15]）。

图14 circRNA中具有IRES-like功能的序列元件分析 （[15]）

2.5 circRNA相互作用分子研究

分子间相互作用是生物分子发挥功能的重要方式，circRNA很多功能也是基于与其他分子的相互作用实现的，典型的包括竞争性结合miRNA的“miRNA Sponge”模型，与蛋白相互作用。2019年circRNA的研究的深度比此前有了很大的进步，绝大部分涉及到特定circRNA的研究都对其功能机制进行了分析。结合miRNA和结合蛋白的研究工作数量都非常大，下面主要选取最有代表性的研究工作进行介绍：

circRNA结合miRNA的研究

2019年4月26日，Cell杂志发表了加拿大多伦多大学Paul C. Boutros教授和Housheng Hansen He教授为共同通讯作者的circRNA研究工作，通过大样本测序和高通量shRNA文库筛选对局限性前列腺癌生长必须的circRNA （essential circRNA）。这项工作是首次利用高通量shRNA文库筛选功能性circRNA分子，这部分将在后面详细探讨。作者一共获得了171种局限性前列腺癌的essential circRNA。作者选择circCSNK1G3进行进一步的分析，作者发现circCSNK1G3可以竞争性结合miR-181b/d。他们的数据表明circCSNK1G3与miR-181b/d的表达数量大致在相同的水平（表达量相差太悬殊不能很好的起到竞争性结合抑制的作用！）。RIP和RNA pull-down实验证明circCSNK1G3可以结合miR-181b/d。干扰circCSNK1G3和过表达miR-181b/d后对CBX7，CDK1和CDC25A（miR-181b/d的靶基因）表达的影响相反。干扰circCSNK1G3后过表达miR-181b/d反而促进增殖，这说明circCSNK1G3结合miR-181b/d后并没有抑制miR-181b/d的活性，而降低circCSNK1G3则导致miR-181b/d无法抑制靶基因的表达（[16]）。这一结果表明circRNA与miRNA的结合并不仅仅通过抑制miRNA的功能这一种途径发挥作用，还存在其他作用机制。

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图15 circCSNK1G3结合miR-181b/d （[16]）

circRNA结合蛋白研究

circRNA结合蛋白是另一种基于相互作用发挥功能的机制模型。2019年这方面也报道了很多重要的发现，包括circACC1与AMPK酶的结合，circYAP拮抗其YAP蛋白翻译过程等等。

2019年5月30日，Cell Metabolism杂志发表了一篇circRNA的研究论文，报道发现circACC1可以与AMPK的β和γ亚基相互作用，并促进AMPK的稳定性，同时参与维持AMPK基础活性。文章的通讯作者是中国科学技术大学的吴缅教授和安徽医科大学的胡汪来教授。文章先从筛选脂代谢相关基因来源的circRNA是否与脂代谢相关入手，找到了circACC1分子，然后进一步确认了circACC1与脂代谢的相关性，进一步分析了ACC1，AMPK等代谢酶和调控基因的表达和磷酸化状态和表达水平，发现了干扰circACC1能够降低ACC1，FPKFB3的磷酸化水平，同时也降低AMPK磷酸化水平及亚基的丰度。这些发现暗示了circACC1可能与AMPK的功能有关系，相互作用分析确认了circACC1与AMPK的β和γ亚基可直接相互作用，突变分析找出了它们相互作用的区段。作者还发现了血清饥饿可通过c-Jun激活circACC1的表达。最后肿瘤学功能分析表明circACC1具有促进肿瘤生长的作用，病人标本中也存在较高比例的circACC1高表达情况（[17]）。

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图16 circACC1与AMPK β和γ亚基相互作用 （[17]）

2019年5月15日，加拿大多伦多大学杨柏华教授团队首次报道发现YAP基因来源的circRNA可拮抗YAP的mRNA翻译起始过程，调控其母基因的翻译效率。YAP是Hippo通路的关键分子之一，与肿瘤发展进程密切相关。本文作者发现来自YAP1基因的4-5外显子的circRNA，circYAP（circBank ID：hsa_circYAP1_008）可以通过结合翻译起始蛋白eIF4G和PABP，抑制母基因YAP的mRNA翻译起始，调控YAP蛋白的表达量，首次发现circRNA通过调控翻译起始效率调控母基因功能（[18]）。

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图17 circYAP调控YAP蛋白翻译 （[18]）

2.6 circRNA降解机制研究进展

circRNA的降解机制此前的研究相对薄弱，2019年在circRNA降解机制方面有了很大的进步，首次报道m⁶A修饰可以通过募集RNase P/MRP复合物介导RNA的切割和降解，这一机制的底物可以是线性RNA，也可以是circRNA，此外还报道发现了果蝇GW182可以介导circRNA的降解，人类的三个同源基因（TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C）也具有降解circRNA的作用。

m⁶A通过募集RNase P/MRP复合物介导circRNA降解

2019年4月2日，Molecular Cell杂志在线发表了一篇有关RNA降解的文章，介绍发现一种m⁶A介导的RNA降解机制。m⁶A识别蛋白YTHDF2结合靶分子，并募集HRSP12，进而介导RNA内切核酸酶RNase P/MRP复合物切割靶分子。这一过程可作用于mRNA和circRNA（[19]）。文章的通讯作者是韩国高丽大学的Yoon Ki Kim。

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图18 m⁶A通过介导线性RNA和circRNA降解的机制 （[19]）

果蝇GW182可调控circRNA的降解，人类的同源基因也有相似功能

2019年9月17日，Nature 子刊Cell Discovery在线发表了一篇circRNA降解机制的研究论文，报道发现GW182介导circRNA的降解作用。作者基于RNAi文库技术在果蝇DL1 和 S2细胞中进行筛选分析，文库由靶向31种已知的RNA代谢和降解作用有关的基因构成。通过QPCR检测dati和 laccase2基因的线性和环状RNA的稳定性状态的结果来分析靶分子是否参与circRNA的降解作用。最终发现GW182具有介导circRNA降解的作用。人类基因中GW182的同源基因有三个：TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C。分别干扰三种基因后均可显著富集circRNA，说明TNRC6A/B/C均参与了circRNA的降解作用（[20]）。文章的通讯作者是重庆大学黄川教授。

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图19 人类TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C可介导circRNA 降解 （[20]）

2.7 circRNA与免疫效应

免疫系统是机体抵御病原体侵害的重要保障，很多病毒基因组以RNA形式存在，机体抵御外源RNA分子的免疫效应机制是一个重要的科学问题，目前已知机体主要通过RIG-I，TLR-3/7/8等受体对外源RNA分子进行识别，随后激活免疫系统，达到清除病毒的作用。。circRNA作为常见的RNA分子形式，在免疫通路中如何发挥作用此前还没有系统的研究报道。2019年关于circRNA与免疫效应关系的研究取得了不小的进展，包括首次报道发现circRNA特定结构在先天免疫调控中发挥重要作用，外源合成circRNA诱导细胞免疫效应通路激活机制的发现。

circRNA调控天然免疫通路

2019年4月25日，Cell杂志发表文章介绍发现circRNA参与细胞抗病毒免疫效应机制，该机制在系统性红斑狼疮等自身免疫疾病中发挥特殊作用。文中作者发现许多circRNA倾向于形成16-26bp不等的小颈环结构，该结构可结合并抑制双链RNA依赖性蛋白激酶R（double-stranded RNA-activated protein kinase，PKR），当细胞受到poly(I:C)刺激处理或病毒感染时，核酸内切酶RNase L激活并降解circRNA分子，PKR被释放并激活下游抗病毒效应机制。系统性红斑狼疮（Systematic lupus erythematosus，SLE）患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中circRNA总体降低，PKR活性紊乱，但人为过表达circRNA有助于降低SLE患者PBMC中PKR的活性，将来或许有助于SLE等自身免疫疾病的治疗（[21]）。文章的通讯作者是陈玲玲教授，杨力教授和上海交通大学医学院附属仁济医院沈南教授。

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图20 circRNA特殊结构调控天然免疫效应通路 （[21]）

外源circRNA与免疫效应通路的关系

早在2017年，Howard Y. Chang就曾经在Molecular Cell杂志报道细胞可以通过RIG-I识别细胞内生成的circRNA（内源circRNA）和体外合成环化的circRNA（外源circRNA），RIG-I识别外源circRNA后可激活自身免疫效应通路（[22]）（推荐阅读：Molecular Cell：细胞识别内源/外源circRNA的机制）。然而2019年3月19日发表在Molecular Cell的一篇文章却给出结论，外源合成的circRNA不诱发免疫效应通路，是很好的表达蛋白的工具（[23]）（推荐阅读：环化的RNA不诱发免疫反应，且可以高效翻译蛋白），这篇文章的通讯作者是麻省理工学院的Daniel G. Anderson教授。

但随后在8月30日Howard Y. Chang团队再次在Molecular Cell杂志发表文章证明了外源合成的circRNA确实可以诱导自身免疫效应相关的通路，他们发现细胞通过识别是否携带m⁶A修饰来识别内源和外源circRNA，外源的不带m⁶A修饰的circRNA可以激活内源性自身免疫效应相关的通路（[24]）。

图21 circRNA通过RIG-I诱导先天免疫应答分子机制 （[24]）

2.8 circRNA与表观遗传

表观遗传学是调控基因表达的重要机制，circRNA在表观遗传机制中的作用研究相对比较薄弱，2018年曾经有一篇研究文章报道circFLI1可调控启动子的甲基化修饰状态（[25]）。2019年在该方向取得了一些进展，包括发现超级增强子调控circNfix的表达。circHuR等核定位的circRNA通过调控相关转录因子的结合特性调控基因表达。

超级增强子调控circNfix的表达

2019年6月18日，Circulation杂志发表了南方医科大学南方医院宾建平团队的一项研究成果，报道超级增强子调控的circNfix缺失可诱导成年小鼠心肌梗死后心脏再生。该研究鉴定出与心脏再生相关的circRNA：circNfix，转录因子Meis1可结合在circNifx的超级增强子上，促进circNifx的高表达；circNifx表达下调可以促进心肌细胞的增殖和血管生成，而抑制心肌梗死后心肌细胞的凋亡，从而改善心肌功能和预后（[26]）。

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图22 circNfix减弱小鼠心肌梗死后心脏再生的作用机制 （[26]）

核定位circRNA调控转录因子结合特性

转录因子结合到基因的启动子区并调控下游基因的表达，一些表观遗传调控的机制就是通过影响转录因子结合能力而实现对特定基因表达状态的调控的，如启动子区的DNA甲基化，组蛋白的甲基化，乙酰化等修饰状态。一些非编码RNA也可以通过影响转录因子的结合特性调控相关基因的转录状态，因此也是表观遗传调控的一种机制。2019年多篇文章报道circRNA也可以通过影响转录因子的结合特性实现对一些基因的表达状态调控，因此可以认为这些circRNA也参与了表观遗传行为。

2019年7月19日，Molecular Cancer杂志发表了桂林医学院附属医院 Li Bin为通讯作者的文章，介绍环状RNA circRHOT1通过启动NR2F6表达促进肝细胞癌的进程。作者基于在线数据分析和验证，发现circRHOT1在HCC中显著上调。研究者用生物素标记的circRHOT1特异性探针进行RNA pulldown实验，发现circRHOT1将TIP60募集到NR2F6启动子区并启动NR2F6的转录（[27]）。

2019年11月13日，华中科技大学同济医学院附属协和医院的童强松教授和郑丽端教授团队在Molecular Cancer杂志上发表了一项circRNA的研究工作，报道Circ-HuR（hsa_circ_0049027）可以与CNBP结合并抑制其与HuR启动子的结合，从而导致HuR的下调（[28]）。

图23 circ-HuR结合CNBP阻止其与HuR启动子的结合 （[28]）

2019年11月11日，EMBO Molecular Medicine杂志在线发表了华中科技大学同济医学院附属协和医院的童强松教授和郑丽端教授团队的一项circRNA研究工作，报道转录因子CUX1来源circRNA（circ-CUX1）通过与EWS RNA结合蛋白1（EWSR1）结合并促进EWSR1与MAZ（MYC-associated zinc finger protein）的相互作用，从而促进神经母细胞瘤细胞的有氧糖酵解，生长和侵袭，从而导致MAZ反激活以及 CUX1和其他与肿瘤进程相关的基因的转录变化（[29]）。

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图24 circ-CUX1结合EWSR1，促进后者与MAZ的结合 （[29]）

3. 人类疾病相关circRNA主要进展概述

3.1 肿瘤相关circRNA研究进展汇总

肿瘤一直是circRNA研究最活跃的疾病类型，2019年circRNA的研究论文和国家自然科学基金项目中，肿瘤学依然是绝对的主角。由于肿瘤相关circRNA研究体量非常巨大，完整的汇总需要非常大的篇幅，在此仅选择几项比较有代表性的研究工作：

肿瘤相关circRNA表达分析

2019年2月7日，Cell杂志在线发表了美国密歇根大学的Arul M. Chinnaiyan教授团队是一项工作，从外显子芯片数据分析了2000例，26种肿瘤中circRNA的表达情况，汇总形成了人类泛肿瘤circRNA表达数据，并构建了数据库MiOncoCirc（https://mioncocirc.github.io/） （[5]）。

推荐阅读：重磅！ Cell杂志同期发表两篇circRNA研究文章。

图25 人类泛肿瘤circRNA表达数据库 （[8]）

circMYBL2是FLT3-ITD型AML潜在的治疗靶点

2019年8月18日，血液学顶级杂志Blood发表了一篇circRNA的研究论文，报道在FLT3-ITD型急性髓系白血病（AML）中circMYBL2通过结合PTBP1促进FLT3蛋白翻译。文章的通讯作者是中山大学的陈月琴教授。

FLT3-ITD是在FLT3基因中间的一段串联重复序列突变，该突变可导致Y591的自磷酸化，进而激发下游通路的过度激活，最终促进白血病的进程。FLT3-ITD突变型的AML病人预后较差且容易复发。FLT3的抑制剂可缓解这类白血病患者病情，但往往会因为FLT3基因的二次突变而导致耐药。因此，依然需要开发FLT3突变AML疾病新的治疗靶点。本文基于GEO数据分析，筛选到来自MYBL2基因的一个circRNA分子（circMYBL2），circMYBL2可以特异性的在FLT3-ITD阳性的AML细胞系中促进细胞增殖。机制方面，circMYBL2可通过结合PTBP1促进FLT3蛋白的翻译效率，进而促进疾病进程。有趣的是，作者的结果表明干扰circMYBL2对于FLT3抑制剂耐药的细胞也是有效的，说明circMYBL2是一个潜在的FLT3-ITD AML的治疗靶点（[30]）。

推荐阅读：Blood | circMYBL2是FLT3-ITD型AML潜在的治疗靶点

图26 circMYBL2结合PTBP1促进FLT3蛋白翻译 （[30]）

Hepatology杂志发表多篇肝癌相关circRNA文章

2019年著名肝脏学杂志Hepatology发表了多篇circRNA的研究论文，报道肝癌相关circRNA的研究。

2019年4月20日， 南京医科大学附属鼓楼医院姜润秋和东南大学医学院王学浩为共同通讯作者在Hepatology在线发表了一项肝癌circRNA的文章，介绍发现circMAT2B通过调控miR-338-3p影响PKM2，促进肿瘤细胞糖酵解效应和肿瘤恶变（[31]）。推荐阅读：Hepatology | 肝细胞癌中circMAT2B促进糖酵解与肿瘤恶变

图27 circMAT2B与糖酵解有关 （[31]）

2019年5月30日，第二军医大学东方肝胆外科研究所的王红阳院士和Li Liang研究员在Hepatology杂志发表文章，报道发现Circ-CDYL在肝癌早期诊断中的价值。作者对早期肝癌组织进行全面的mRNA, circRNA和microRNA表达谱分析，筛选到在早期肝癌中特异性表达上调的Circ-CDYL，体内和体外实验验证了Circ-CDYL调控 HDGF下游的NCL-PI3K-AKT和HIF1AN下游NOTCH2信号通路的活化，上调致癌蛋白c-myc和SURVIVIN表达，促进早期肝癌的发生发展。结合临床样本分析，验证联合Circ-CDYL、HDGF 和 HIF1AN三个生物标志物可有效诊断早期肝癌，提高了其诊断的灵敏性和特异性（[32]）。推荐阅读：HEPATOLOGY | Circ-CDYL在早期肝癌中特异性表达

图28 Circ-CDYL 联合 HDGF、HIF1AN分子诊断早期肝癌 （[32]）

2019年12月15日，复旦大学附属中山医院肝癌研究所周俭教授在Hepatology杂志发表文章，报道发现CircASAP1是肝细胞癌转移的关键调节因子。作者发现circASAP1与HCC患者根治性切除术后的肺转移有关，在miR-326 / miR-532-5p-MAPK1 / CSF-1信号转导中起着重要作用，可作为HCC患者的预后预测指标（[33]）。

图29 CircASAP1在HCC中的表达与作用机制 （[33]）

肠癌相关circRNA组合标志物cirScore

2019年9月2日，EMBO Mol Med在线发表一篇circRNA文章，来自中山大学附属肿瘤医院的研究团队采用高通量测序数据系统的鉴定和筛选了一批可用于中期结肠癌复发预测的circRNA，并在第三方数据中得到验证。中山大学附属肿瘤医院的徐瑞华教授为该文章通讯作者，鞠怀强副研究员，赵齐博士、王峰副主任医师、王梓贤博士及中山大学附属第六医院的兰平教授为文章共同第一作者。作者将筛选的circRNA进行线性组合，利用训练数据集构建了基于circRNA预测中期结肠癌复发的分子标签cirScore。性能评估表明，该指标可以在结肠癌患者中有效区分高危复发组和低危复发组。此外，作者还收集了本院122例和来自中山大学附属第六医院的180结肠癌病人样本作为内部验证集和外部验证数据集对标签性能进行验证。结果显示，该指标可以在外部的数据集中得到验证。通过比较，作者发现高cirScore的患者复发风险是低cirScore的2倍以上。且高cirScore的患者总生存期也显著长于低cirScore患者（[34]）。

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图31 cirScore用于肠癌临床预后分析 （[34]）

3.2 心血管疾病相关circRNA研究进展汇总

2019年circRNA在心血管疾病方面也有一系列进展，下面选取几个有代表性的研究工作进行介绍：

circ_Lrp6调控VSMCs的功能

2019年2月15日，Circulation Research在线发表了意大利Humanitas Research Hospital的Gianluigi Condorelli和Leonardo Elia为共同通讯作者的文章，报道发现在血管平滑肌细胞（VSMCs）中Lrp6来源的circ_Lrp6可以通过竞争性结合miR-145上调其靶基因ITGβ8, FASCIN, KLF4, Yes1和Lox的表达，影响血管疾病的发病过程。在小鼠和人的血管疾病过程中，miR-145和circ_Lrp6的表达水平是存在差异调控的，而调节circ_Lrp6的表达可以影响到血管疾病的发展。在VSMCs中，circ_Lrp6具有促细胞增殖的效应，而miR-145具有促细胞分化的效应。当血管疾病发生发展的时候，内膜增生，血管平滑肌细胞中的miR-145表达下调，circ_Lrp6的表达可不发生改变。而当人为地敲低circ_Lrp6的表达，则上调miR-145的表达，进一步抑制内膜增生的程度，抑制血管变窄导致的后续血管疾病的发生发展（[35]）。

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图32 Circ_Lrp6的组织表达和调控 （[35]）

circFndc3b促进心肌修复

2019年9月20日，Nature Communications期刊在线发表了美国费城天普大学 Raj Kishore为通讯作者的文章，报道发现在发生心肌梗死MI的小鼠心脏中表达出现明显下调的circFndc3b，体内和体外结果均显示circFndc3b过表达有助于减轻心肌细胞和内皮的凋亡，改善心肌功能。进一步的机制研究，证明circFndc3b并不作为miRNA的海绵而发挥功能，而是与RNA结合蛋白FUS相互结合，正向调控VEGF-A的表达，从而改善梗死后心肌的功能和重建（[36]）。

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图33 circFndc3b介导的心脏修复的机制 （[36]）

cPWWP2A改善糖尿病引起的视网膜血管病变

2019年4月9日，PNAS杂志在线发表了复旦大学上海医学院附属耳鼻喉眼科医院颜标研究团队的一项研究成果，报道发现cPWWP2A可以改善糖尿病引起的视网膜血管病变。该研究显示糖尿病应激上调视网膜周细胞，而不是内皮细胞中cPWWP2A的表达水平。体外研究表明，cPWWP2A充当内源性miR-579的海绵，调控Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1基因的表达，直接调节周细胞生物学功能，而通过携带cPWWP2A的外泌体间接调节ECs生物学功能，促进ECs的迁移和血管形成能力。体内研究表明，cPWWP2A过表达或抑制miR-579表达可减轻糖尿病引起的视网膜血管功能障碍。相反，抑制cPWWP2A表达或过表达miR-579会加重视网膜血管功能障碍。这项研究揭示了周细胞和ECs “对话”的新机制，干预cPWWP2A或miR-579的表达可为治疗糖尿病微血管并发症提供治疗策略（[37]）。

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3.3 其他人类疾病相关circRNA研究进展汇总

除了肿瘤和心血管疾病，其他类型的人类疾病也有不少circRNA的研究工作，也是由于体量较大，这里仅选择在神经性疼痛中探索circAnks1a机制的研究工作，这个故事中circRNA既有miRNA Spong的功能，也可以结合蛋白，因此是非常有趣，也非常典型的circRNA研究工作，因此选这个文章给大家做介绍。

circAnks1a在神经性疼痛中的作用

2019年9月11日，Nature Communications在线发表了一篇circRNA的研究文章，报道脊髓中circAnks1a在神经性疼痛的啮齿类模型中调节超敏反应。文章的通讯作者是中山大学医学院信文君教授，徐婷和中山大学孙逸仙纪念医院马超教授。本文主要基于大鼠脊神经结扎的模型分析了差异变化的circRNA，找到了circAnks1a，并验证了circAnks1a与神经性疼痛的相关性。机制方面作者发现circAnks1a可以促进YBX1的入核和结合VEGFB启动子，促进其表达，还可以通过竞争性结合miR-324-3p调控VEGFB的表达。两种机制共同促进了VEGFB的表达，最终介导神经性疼痛的生理过程（[38]）。

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图34  circAnks1a的验证和分析 （[38]）

4. circRNA研究工具与方法进展

2019年circRNA取得了骄人的成绩，也涌现出一批新的circRNA研究技术方法和工具，这一部分我们将梳理一下这方面的主要进展。

4.1 circRNA研究新技术方法

靶向circRNA分子的高通量shRNA文库技术

2019年4月26日，Cell杂志发表了加拿大多伦多大学Paul C. Boutros教授和Housheng Hansen He教授为共同通讯作者的circRNA研究工作，通过大样本测序和高通量shRNA文库筛选对局限性前列腺癌生长必须的circRNA （essential circRNA）。作者首先通过对144对前列腺癌/癌旁配对标本进行深度测序，分析得出前列腺癌特异性的circRNA，挑选表达丰度靠前的2000个circRNA设计shRNA，为减少脱靶效应带来的假阳性结果的干扰，作者在这些circRNA所对应的mRNA中也设计了对照shRNA。最终所获得的shRNA共靶向1507种circRNA和对应来源基因的1075种mRNA的shRNA文库。经过负选择筛选分析，最终获得了171种前列腺癌相关的essential circRNA分子（[16]）。

图35 高通量shRNA文库筛选前列腺癌essential circRNA （[16]）

circRNA敲除体系

2019年1月15日，Nature Immunology在线发表了中国科学院生物物理研究所田勇教授和范祖森教授为共同通讯作者的文章，介绍发现来自Pan3基因的环状RNA circPan3在IL-13调控的肠道干细胞自我更新过程中发挥重要调控作用。文章构建了circPan3的敲除模型。小鼠中不存在Alu序列，促进circRNA形成的往往是一些SINE元件，因此作者需要首先确认需要打靶的circRNA是由什么序列介导形成circRNA的。作者的策略是在小鼠的Lgr5⁺ISCs细胞中通过慢病毒载体构建mini-gene，模拟体内成环的过程。基于这一技术路线，可以通过构建删除特定内含子片段分析介导所感兴趣的circRNA由哪些序列元件介导的。作者就是通过这种技术路线找出了介导circPan3生成的内含子序列，如下图中a所示的#1和#2位置，Northern杂交也证明了删除#2的mini-gene不再表达circPan3。有了这个基础才能设计出专门针对circPan3的敲除方案，作者设计了靶向#2位置的打靶体系，最终获得了准确删除该位点的小鼠，经过鉴定，该小鼠中circPan3被准确敲除，与此同时，Pan3基因的其他转录产物（下图f中靠上侧的一坨）没有受到明显的影响，Pan3蛋白也没有明显的变化（[39]）。

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图36 circPan3敲除模型构建策略（[39]）

基于环状RNA高效表达核酸适配体

2019年4月8日， Nature Biotechnology在线发表了洛克菲勒大学Samie R. Jaffrey教授为通讯作者的文章，报道开发一种基于circRNA高效表达核酸适配体（aptamer）的技术体系。该环状RNA表达体系被命名为“Tornado”， 该技术是基于具有自剪切功能的核酶（Ribosome）实现待环化序列的上下游切割，环化作用则借助于内源的RNA连接酶RtcB实现，最终的产物包含了待环化序列以及为实现环化而携带的Ligated stem序列（racRNA） （[40]）。Tornado环状RNA过表达体系具有自动剪切，自动环化，表达高效且可实现适体体内过表达的优点，为环状RNA的过表达开辟了新途径。

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图37 Tornado环状RNA过表达载体 （[40]）

改良的基于RNase R富集circRNA技术

2019年9月19日，Nucleic Acids Res杂志发表了一种circRNA富集纯化技术的文章，报道一种改良的基于RNase R富集circRNA的技术方法。该研究中，作者证明涉及RNase R的标准方案> 20％高表达的线性RNA不能消化，但这些缺点可以在很大程度上克服。具有高度结构化的3’末端的RNA（包括snRNA和组蛋白mRNA）天然地对RNase R具有抗性，但是一旦将poly（A）尾添加到其末端，就可以有效降解。此外，RNase R在许多多腺苷酸化mRNA的体内停滞，特别是在以前注释为G-四链体（G4）结构的富含G的序列中。在用反应缓冲液中的Li +代替K +（其稳定G4s）后，作者发现RNase R能够将这些序列进行并完全降解mRNA。该研究的结果为目前用于分离环状RNA的方法提供了重要的改进，以及揭示可以天然抑制细胞核酸外切酶降解RNA结构的方法（[41]）。文章的通讯作者是美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Jeremy E. Wilusz。

图38 改良的基于RNase R富集circRNA技术 （[41]）

4.2 circRNA研究的信息学工具与数据库

CircSplice新工具全面挖掘癌症特异性circRNA选择性剪切事件

2019年3月8日，Molecular Cancer杂志在线发表了武汉大学何春江教授团队开发了一种全新的从头算法工具CircSplice，它可以识别circRNA中的内部选择性剪接，并比较不同条件之间的差异circRNA剪接事件。通过CircSplice对透明细胞肾细胞癌和膀胱癌数据挖掘后，分别在两个数据集中检测到4498和2977个circRNA可变剪接（circ-AS）事件，并通过RT-PCR证实了circ-AS事件的表达。研究者进一步检查了癌症和邻近正常组织中circ-AS的分布和模式，为了进一步了解癌症特异性circ-AS的潜在功能，将这些剪切事件分类为肿瘤抑制因子和癌基因，进行了信号通路富集分析。该研究开发的工具可首次全面了解癌症特异性circRNA选择性剪接，对癌症中circRNA的调控和功能研究有重要贡献（[42]）。

该工具网址链接http://gb.whu.edu.cn/CircSplice或https://github.com/ GeneFeng / CircSplice

图39 CircSplice支持鉴定四种circRNA可变剪切事件类型 （[42]）

circAtlas: 多物种circRNA表达数据库

2019年3月19日，Cell Reports杂志发表了中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员团队的一项研究成果，利用高通量测序技术对人、猴和小鼠的44个正常组织进行转录组评估，鉴定出大量circRNA分子，并重建72.6%的circRNA全长序列，为circRNA的可变剪切、保守性以及与线性RNA的关系研究提供了重要数据资源。该研究成果已汇总到circAtlas数据库中。circAtlas数据库提供界面友好的数据检索和呈现方式，包括了多项circRNA资源，如circRNA及其宿主基因在各组织中表达值，miRNA和RBP（RNA结合蛋白）预测信息；circRNA在人、猴、小鼠、大鼠、猪、鸡和狗7物种中保守性；circRNA蛋白翻译相关的ORF和IRES信息；文献报道疾病相关的circRNA收录等信息（[43]）。

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图40 circAtlas数据库 （[43]）

Ularcirc： circRNA分析及可视化工具

2019年11月18日，在线发表了澳大利亚张任谦心脏研究所David T. Humphreys为通讯作者的文章，报道Ularcirc工具。该文献作者开发的Ularcirc的软件工具，它集成了识别反向剪接位点和正向剪接位点的可视化功能，并能对鉴定的circRNA进行下游分析。 Ularcirc可利用CIRI、circExplorer或STAR比对软件的原始输出结果，组装环状RNA的反向剪接位点（BSJ）计数表，并允许多样本分析。研究者使用Ularcirc工具分别从公共和内部生成的数据集中识别和表征circRNA，并演示了它如何用于(i)发现新的亲本转录本剪接模式，(ii)检测circRNA的内部剪接模式，(iii)以及揭示反向剪接位点（BSJ）形成的复杂性。 此外，该研究还确定了circRNA可能具有比亲本转录本线性序列更长的开放阅读框。最后，我们检测并验证了由ApoA4转录本产生的一类新型环状circRNA的存在，其反向剪接位点（BSJ）来自编码外显子内的多个非经典剪接位点（[44]）。

图41 Ularcirc工具集工作流程（[44]）

环状RNA在约1000种人癌细胞系中的综合表征研究

2019年8月26日，Genome Medicine杂志发表了德州大学休斯敦健康科学中心韩冷教授团队的一项工作，报道分析了超过1000种人类癌症细胞系中circRNA表达分析的结果。人癌细胞系是癌症研究和开发治疗策略的基本模型。然而，目前在许多癌细胞系中并没有表征环状RNA（circRNA）的数据。该研究中，研究者对CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia，癌症细胞系百科全书）数据库中的RNA-seq数据，应用四种circRNA识别算法分析了约1000种人癌细胞系中circRNA的表达谱特征，还综合分析探索不同癌症谱系中circRNA的表达情况，生物形成，细胞功能和药物反应等。研究结果揭示了circRNA在不同癌症细胞中具有高度特异性表达模式，表明circRNA可能是癌症治疗中强有力的诊断或预后标志物。研究者还通过实验鉴定了涉及circRNA生物形成的关键基因，证实TGF-β信号通路在该过程中起到重要作用。更引人注目的是，研究者发现一些癌症临床上常见基因上富集RNA结合蛋白（RBP），更可能产生circRNA。其中，circMYC可促进细胞增殖。我们观察到circRNA的表达与药物反应之间的强烈关联，特别是那些靶向染色质组蛋白乙酰化的药物。同时，该研究还开发了一个癌细胞系circRNA数据库——CircRiC（https：//hanlab.uth.edu/cRic），该数据库目前包含了来自CCLE的22个癌症谱系中935个癌细胞系中circRNA的表达特征、生物形成、药物应答和整合分析等数据，对circRNA研究提供了非常有意义的参考（[45]）。

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图42 circRic数据库主页 （[45]）

NPInter v4.0：非编码RNA互作数据库。

2019年10月31日，Nucleic Acids Res发表了更新版的NPInter v4.0数据库，文章的通讯作者是中国科学院生物物理研究所陈润生院士，何顺民研究员和中国科学院计算技术研究所赵屹研究员。非编码RNA（ncRNA）在多种生物信号通路中起着至关重要的调控作用。已有研究表明非编码RNA可以与蛋白、RNA以及基因组相互作用，调控复杂生物过程。陈润生院士课题组早在2006年发布了NPInter数据库，近日该数据库已更新至第4版，NPInter（NPInter v4.0)数据库系统地收录了绝大多数种类非编码RNA（新增circRNA）的相互作用，并对相互作用以及相关分子进行了详细的注释以及可视化，提供了一个全面、系统的非编码RNA相互作用的研究平台。环状RNA（circRNA）的相互作用和ChIRP-seq获得的非编码RNA-基因组的相互作用首次被收录进来。总数据量上升到11万条，涵盖了35个物种。相互作用以及作用分子还增加了疾病注释，可帮助研究者更好地理解相互作用的功能。除了整合数据之外，整个数据库的网站也进行了重新构建，提高了原有搜索模块的易用性（[46]）。数据库网址为：http://bigdata.ibp.ac.cn/npinter4

图43 NPInter v4.0数据库首页 （[46]）

5. 非医学相关circRNA研究进展

非医学相关的circRNA研究总体体量比较小，受众面也比较窄，常见的研究主要基于表达谱分析和基于miRNA的互作网络预测分析，因此选择下面这个工作作为代表进行介绍：

EpCAM敲除小鼠circRNA表达谱分析

2019年7月8日，International Journal of Molecular Medicine杂志在线发表了中科院广州生物医药与健康研究院赖良学教授和广东中医药大学广东省中西医结合代谢病研究中心郭姣教授为共同通讯作者的文章，报道分析了EpCAM敲除老鼠中circRNA的表达状态。作者利用Cas-9技术构建了EpCAM敲除老鼠，并分析了肝脏中非编码RNA的表达情。测序的结果显示11个上调和12个下调的circRNA（[47]）。

图44 EpCAM敲除老鼠肝脏circRNA表达分析 （[47]）

6. circRNA重要综述

Nature Reviews Genetics：circRNA的生成和特征

2019年8月8日，Nature Reviews Genetics发表了一篇circRNA的综述文章，系统回顾介绍了circRNA研究的主要进展，包括circRNA的形成，检测方法，主要功能机制，主要研究技术等。文章的通讯作者是丹麦奥胡斯大学的Lasse S. Kristensen，其中著名circRNA研究专家Jørgen Kjems教授是本文的共同作者。

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图45 目前检测和定量circRNA的主要技术列表（[48]）

EMBO Journal：circRNA的过去，现在和将来

2019年7月25日，美国Brandeis大学生物系的Sebastian Kadener等人在EMBO Journal杂志上在线发表了circRNA的综述，回顾了circRNA的研究历程，主要进展和将来的发展趋势 （[49]）。

7. circRNA研究总体趋势与未解决的问题汇总分析

2019年circRNA延续了迅猛的发展态势，在发表论文总数目，尤其是大于10分的高质量论文数目出现了巨大的增长，国家自然科学基金的项目数也维持了去年的水平。circRNA虽然已经有了多年的研究，但依然有若干重要的问题没有得到有效解决，概括而言，包括如下问题：

（1）circRNA组织/疾病特异性表达的机制；circRNA的组织/疾病特异性表达特征已经有了一定的认知，但产生这种特异性的机制的认识还非常有限。

（2）泛组织circRNA表达谱分析；目前绝大部分研究工作均聚焦于特定组织或疾病标本中的表达分析，但从一些泛组织/疾病表达谱分析的结果来看，组织特异性的表达特征认识还比较局限，因此这方面的工作依然需要加强，尤其是同步分析不同组织间的表达差异。

（3）敲除技术和基因改造动物模型问题；circRNA的敲除是非常有挑战性的工作，目前也仅有少数几篇文章用到了敲除模型，但从回答circRNA的生理/病理意义的角度而言，敲除模型是非常重要的科学证据，因此未来针对特定circRNA分子的敲除模型可能会越来越多。

（4）circRNA精确的亚细胞定位和活细胞成像观测；生物分子的亚细胞定位是决定其功能和互作分子的一个重要特征。目前对circRNA的亚细胞定位认识非常有限，这方面的研究几乎刚刚起步的状态。

（5）circRNA二级结构分析与动力学研究；结构是决定功能的关键，circRNA的二级结构的研究一直比较有限，2019年陈玲玲教授和杨力教授的Cell文章就是发现了circRNA一种特殊的结构状态，并发现它们与自身免疫效应通路的关系。未来有关circRNA二级/高级结构及分子动力学的研究将是重要的发展方向。

（6）circRNA修饰谱分析；目前circRNA中仅有m6A修饰的文章报道，但RNA中有多达150种的修饰方式，绝大部分的研究依然非常有限，因此有关circRNA的秀食谱将是非常有潜力的研究方向。

（7）同一circRNA分子不同机制的研究；circRNA研究发展到今天，很多的研究都聚焦于同一个circRNA分子，因此关于同一个分子在不同组织或疾病中的功能机制将是circRNA接下来研究的重要方向，相互作用蛋白，转录后修饰以及是否可以翻译都是值得思考的功能机制方向。

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往年国自然项目总体情况

2016年至2018年三年circRNA的国自然项目出现了爆发式增长，2019年与2018年总体数目一致，但学科分布的范围更广了，说明circRNA研究者数量趋于稳定，但有一些学科方向的研究者正慢慢加入circRNA研究大军。按照国自然总体获批比例的情况估算，国内从事circRNA相关研究的研究者总量应该在一千左右。常见疾病中基本都有circRNA的文章和项目了，但一些特殊疾病类型或亚型依然需要circRNA的表达谱研究。此外传统的生物化学与分子生物学，细胞生物学，遗传发育学，干细胞与再生医学等学科方向circRNA项目数偏少。

推荐阅读：

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表1 近四年国自然项目基本信息汇总

circRNA研究的几个热点方向回顾分析

随着circRNA研究的不断深入，一些常见和新兴的研究方向和思路在国自然项目中的数目变化情况是非常重要的信息。为此，我们从项目的题目中检索汇总了“外泌体”、“miRNA”、“结合蛋白”和“翻译”四个关键词，汇总了这些关键词相关的项目数量变化趋势，希望对大家设计课题方向有所帮助。

表2 热点关键词汇总 （仅依据项目题目检索分析所得）

从汇总的数据来看，miRNA的研究思路依然是主流，外泌体，结合蛋白和翻译的项目都有较明显的上升。随着circRNA的研究不断推进，大家也会发现测序和芯片结果中熟悉的面孔越来越多，因此下一步就会面临一个很重要的问题：同一个circRNA分子在不同研究对象中的机制该如何去探索？除了在同一个circRNA分子中选择不同的miRNA分子，分析circRNA的结合蛋白，或者是否可以翻译等新角度必然会越来越受大家的欢迎。可以预期的是circRNA的结合蛋白及是否翻译，以及circRNA的修饰和二级结构分析等思路是下一步circRNA研究的重点发展方向。

近期若干研究热点汇总

创新性是国自然项目的灵魂，用新思路，新方法或者新角度来设计研究方案解决科学问题可以大大提高项目获得资助的概率。2019年国自然项目中与新热点方向的结合有增多的趋势，如m⁶A修饰，外泌体，细胞焦亡，相分离，铁死亡等热点方向和关键词。在此，我总结了近期的一些热点关键词，列表如下，希望可以给大家开拓思路提供一些帮助。由于能力有限，有些热点的关键词可能并没有列入表内，也希望各位同行们能给予指点。

表3 若干近期研究热点关键词

circRNA研究者的总体体量已经趋于稳定，如何从激烈的竞争中脱颖而出，获得资助是每个同行都在努力思考的问题。近期我们将针对上述的热点方向和关键词汇总相关的研究进展，主要研究技术及相关的circRNA研究情况，希望能为大家的申请书写作和设计提供帮助。

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获批项目研究内容特点分析与2020年申请建议：

2019年获批项目绝大部分均为针对特定circRNA的功能研究，大部分都给出了明确的机制和通路，表明circRNA的功能研究已进入全新的阶段。下面针对2019年获批项目的情况，总结一下所呈现的主要特点：

（1） 学科方向方面，医学领域依然具有压倒性优势，动物学、植物学以及生物信息学方向也有获批的项目。但生物化学和分子生物学，细胞生物学，遗传学，干细胞与再生医学等学科方向的项目偏少。可能与circRNA基础生命科学问题的研究难度有一定关系。

（2）研究内容更加明确和具体。2019年获批的项目从题目中不难看出，大部分都是基于某个特定circRNA分子和特定的通路和机制来写的，说明申请者已对相关分子的功能和作用机制有了较详细的认知。这也说明circRNA的功能和机制的研究已经越来越细致和深入。

（3）circRNA的功能机制模型和通路呈现多样化趋势。2019年获批的项目中除了传统的竞争性结合miRNA功能模式，circRNA直接翻译多肽，与蛋白的相互作用以及circRNA的m6A修饰等功能模型相关的项目越来越多。此外，近几年热度较高的分子细胞生物学机制和通路也在今年获批的cirRNA项目中多次出现，包括m6A修饰，外泌体，细胞焦亡，相分离，铁死亡等等。说明circRNA的研究正越来越融入分子细胞生物学研究中。

针对这些特征，我们对2020年申请circRNA的项目提出几点建议：

（1）申请项目的研究内容应充分论证所选择分子的功能，并适当探索其作用机制和通路，以形成初步的轮廓。

（2）circRNA的机制方面可以适当参考最新的分子细胞生物学进展，探索circRNA在其中发挥的作用是值得借鉴的思路。

（3）一些传统的学科领域中circRNA研究相对不足，包括干细胞与再生医学领域，发育生物学等等。此外，针对circRNA的一些基本科学问题也有待进一步探索，包括circRNA的结构问题，修饰方式及调控机制，组织/疾病特异性的形成机制，circRNA与表观遗传和染色质结构调控的关系，circRNA亚细胞定位的机制等等。

说明：之前公布的基金检索内容不够全面，这一次我们经过认真的检索校正，分别从国家自然科学基金主页和科学网进行了检索比对，最终得到下列名单，借此向国家自然科学基金委员会网站和科学网表示感谢。如有遗漏或表达不准确之处，敬请各位同仁批评指正。

附：2019年获批国家自然科学基金信息列表（按学科代码排名，同一学科代码项目不分先后）

1. 2018年circRNA基金与论文发表情况概述：

1.1 2018年国家自然科学基金circRNA相关基金项目情况汇总

2018年circRNA研究领域在国家自然科学基金中又是一个丰收年，共有258项与circRNA相关的项目获批，其中优秀青年基金项目1项，国际(地区)合作与交流项目1项，面上项目133项，地区基金项目24项，青年科学基金项目99项。涉及的学科方向更加广泛，也呈现的一些特征，概括而言包括：

（1） 医学学科依然是circRNA研究的主要阵地，肿瘤学和循环系统方向是目前circRNA研究最好活跃的学科方向，其他医学学科方向正在慢慢兴起。

（2）circRNA竞争性结合miRNA的机制依然是研究最多的机制模型，但一些新的方向正在悄然兴起，包括circRNA翻译蛋白，与蛋白相互作用等。

（3）circRNA的分子机制总体还是太单一，仍需要开发更有效的分析研究工具。

近三年国家自然科学基金获批数统计如下：

图1 近三年国家自然科学基金circRNA相关项目汇总

1.2 2018年circRNA相关论文发表情况汇总

2018年circRNA研究论文也表现不俗，相对于2017年发表论文总数目实现了143%的增幅，总数量翻了一倍多，覆盖的学科方向更加广泛，医学依然是主要的领域，以肿瘤学为主。2018年circRNA研究论文总体呈现了一些新的特点和趋势，总结而言包括：

（1） 肿瘤学是circRNA发表论文的绝对主力，占了2018年全部circRNA相关论文发表总数的%，涉及的肿瘤类型也更加广泛，包括 肿瘤也在2018年发表了研究论文。

（2）发表论文的主题从高通量筛选过渡至特定分子的功能和机制研究。2018年报道特定circRNA分子功能的文献共有158篇，远高于2017年及之前，说明circRNA研究已经进入特定分子功能研究的阶段。

（3）特定circRNA分子与其来源基因的相互作用关系报道增多。

（4）circRNA基础生物学机制相关研究报道有所下降，包括circRNA的生成机制，新功能模式（包括相互作用分子分析，编码多肽的研究等），RNA修饰，二级结构分析等等，这些基础问题的重要性显而易见，但相关研究报道不太多，可能是由于相关技术分析难度较大，不易快速形成论文成果。

近三年circRNA论文发表情况汇总如下：

图2近三年circRNA论文发表情况汇总

按学科划分，主要发表circRNA研究成果的学科方向和疾病类型汇总论文数目列表如下：

图3 circRNA相关论文学科分布情况

2. circRNA基本生命科学问题研究进展

2018年circRNA基础生命科学研究方面取得的重大进展不算太多，主要包括circRNA出核机制的报道，内含子来源的套索circRNA在胞质中大量存在，反式拼接产物与circRNA的关系，病毒circDNA基因组表达circRNA产物，环形RNA（Cia-cGAS）参与造血干细胞静息状态调控等等。下面就让我们一起回顾一下吧：

CircRNA出核机制

5月17日，Genes & Development杂志在线发表了宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Jeremy E. Wilusz博士为通讯作者的文章，介绍发现了一种调控circRNA转录后出核的机制[1]。

本文作者首先在果蝇中基于shRNA筛选，发现干扰Hel25E后明显导致核内circRNA的富集，进一步验证后表面果蝇中Hel25E是介导circRNA转录后出核的重要调控因子。作者进一步在人的细胞中分析Hel25E的同源分子的作用情况，结果表面Hel25E的同源蛋白UAP56 (DDX39B) 和URH49 (DDX39A)均可介导circRNA的出核，更有趣的是，UAP56主要负责大分子量的circRNA的出核，而URH49主要负责小分子circRNA的出核[1]。这一重大发现初步揭示了circRNA转录后出核的机制，为进一步探索circRNA亚细胞定位的机制提供了重要参考依据，是circRNA机制研究的重大进展。针对这一重大发现，在RNA Biology杂志，Genes & Development杂志和Non-coding RNA Investigation杂志专门做了综述和专题报道[2-4]。

图4 UAP56和URH49分别调控大分子量和小分子circRNA出核 （来自[1]）

转录后分子间反式拼接形成的tsRNA与CircRNA的关系

1月27日的Nucleic Acids Research杂志在线发表了一篇研究论文，报道非共线性（Non-Co-Liner, NCL）转录产物不仅包含传统的circRNA，还可能是分子间反式拼接的产物。该文章的通讯作者是台湾中央研究院基因组研究中心的Trees-Juen Chuang[5]。

将tsRNA的表达与circRNA的表达进行比较和分析具有非凡的意义，对circRNA的研究有重要的启发价值。区分tsRNA和circRNA其实是很简单的，tsRNA是依然是线性的RNA分子，带有Poly(A)尾，可以通过oligo-dT进行富集和反转录验证，而circRNA理论上耐受RNase R的消化，可以通过RNase R消化加以区分。从本文的结果来看，tsRNA的丰度普遍不高，且往往与circRNA伴生，在研究特定circRNA的时候需要增加分析是否存在tsRNA的步骤，如果证明的确有tsRNA，则需要进一步分析tsRNA和circRNA的表达丰度，结合RT-PCR后Sanger测序等技术的手段弄清楚tsRNA和circRNA的序列，在此基础上设计针对不同分子形式的siRNA，这对于解释相关的机制非常重要。

图5 反式拼接与反向拼接 （来自[5]）

脊椎动物细胞质中存在内含子套索circRNA

8月21日，PNAS杂志在线发表了卡内基理工学院Joseph G. Gall教授为通讯作者的文章介绍发现脊椎动物细胞质中广泛存在内含子来源的套索circRNA[6]。

之前大家普遍认为内含子序列在RNA转录后剪接作用后很快会被清除，但本文作者发现在脊椎动物的细胞质中存在大量内含子来源的套索形成的circRNA（5’→2’共价交联的分子），来源于数百种不同的基因。在类，老鼠，鸡，青蛙和斑马鱼的细胞里发现了它们[6]。这些分子在胞质中的作用还未知。

图6 脊椎动物细胞质中存在大量内含子来源的套索circRNA （来自[6]）

病毒环形DNA基因组表达环形RNA产物

8月27日，PNAS杂志在线发表了一项有趣的研究：发现环状DNA病毒基因组能够表达环状RNA的产物！文章的通讯作者是匹兹堡大学的Patrick S. Moore和Yuan Chang[7]。

本文报道的故事概括而言，就是报道发现了两种环状DNA基因组的γ-疱疹病毒：EB病毒（EBV）和卡波西肉瘤病毒（KSHV）可以转录产生病毒基因来源的circRNA分子，EBV病毒能够在BART基因区产生仅有外显子组成的circRNA或同时携带外显子和内含子的circRNA分子，前者在胞质和核中均有定位，后者主要定位于核内。KSHV病毒在IRF4和PAN基因区均发现有对应的circRNA生成，它们在胞质和核内均有分布，其中PAN基因来源的circRNA为簇，且正负两条链都有相应的产物。作者还分析了这些circRNA翻译的潜能，从实验数据来看被核糖体捕获的circRNA偏少，这些circRNA更倾向于分布在游离的RNA，但也不能排除这些circRNA可翻译的可能性[7]。本文为我们呈现了一个非常有趣的现象：环状DNA基因组的病毒在宿主细胞中能够表达出环状RNA的产物，不得不感叹自然进化的玄妙！

图7 circBART测序鉴定（来自[7]）

大脑中一种RNA互作网络：

7月12日，Cell 杂志发表了MIT的David P. Bartel为通讯作者的文章，介绍发现了一个在人类大脑中的RNA间相互作用的调控网络[8]。

该网络由一种lncRNA （Cyrano），一种circRNA （CDR1as）和两种miRNA分子（miR-671和miR-7）之间相互调控的微妙网络体系。Cyrano可以促进miR-7的降解，这有利于维持CDR1as的丰度，之前报道也证明miR-671会通过与CDR1as互补促进后者的降解。因此四种分子会出现此消彼长的微妙调控机制[8]。

图8 四种RNA分子形成的精密的调控网络 （来自[8]）

环形RNA（Cia-cGAS）参与造血干细胞静息状态调控

4月3日，知名免疫学杂志Immunity在线发表了中科院生物物理所范祖森教授与王硕研究员为共同通讯作者的文章，介绍发现环形RNA Cia-cGAS（作者自己命名）定位于细胞核中，可结合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，调控长效造血干细胞（LT-HSC）静息状态[9]。

本文作者首先基于高通量测序比较了小鼠中LT-HSC，ST-HSC和MPPs中全转录组变化情况，这其中共发现了156种存在明显表达差异的circRNA分子，其中49种在LT-HSC中表现为上调。进一步的表达验证中发现有9种circRNA分子在LT-HSC中存在明显的上调。然后通过shRNA实验分析功能，发现其中只有来自D430042O09Rik的circRNA Cia-cGAS干扰后明显改变造血干细胞的亚群分布，因此锁定研究目标为Cia-cGAS分子。作者进一步验证了只有干扰Cia-cGAS才能有明显的效应，而单独干扰D430042O09Rik并无明显表型。然后基于迷你基因载验证，证明Cia-cGAS序列下游的反向互补序列是促进其生成的关键，于是作者通过Cas-9基因敲除策略成功构建了Cia-cGAS基因敲除小鼠。在Cia-cGAS基因敲除小鼠中作者发现LT-HSC明显减少，I型干扰素表达升高。通过RNA Pull-down实验，作者鉴定到Cia-cGAS可以与cGAS结合，又通过RIP，RNA Pull-down，FISH共定位以及EMSA等实验验证了这一相互作用，进一步，作者还通过预测分析结合突变实验分析了Cia-cGAS与cGAS相互作用的位点信息。酶学功能研究证明，Cia-cGAS与cGAS相互作用能够抑制cGAS的活性[9]。

图9 Cia-cGAS结合cGAS抑制cGAS的功能 （来自[9]）

多篇文章介绍组织特异性circRNA表达研究：

2018年有多篇文章报道了组织特异性的circRNA表达特征研究：7月30日Nucleic Acids Research杂志报道人类血液细胞中circRNA广泛表达，且存在细胞特异性[10]。4月24日，Genomics杂志报道人胎儿大脑发育过程中环状RNA表达模式的变化[11]。RNA杂志报道心肌中circRNA主要来源于保守性外显子，而非可变剪切[12]。Non-coding RNA杂志报道胰岛β-细胞中存在细胞特异性的circRNA表达特征[13]。Scientific Reports报道大规模探索人体组织中circRNA的表达情况[14]。

3. 888集团官网游戏 相关性研究进展

circRNA表达特征与人类疾病的相关性是circRNA研究报道最多的领域，也是国家自然科学基金获批最多的方向。以肿瘤为主，还包括心血管疾病，神经退行性疾病等等。由于该方向发表的论文数量非常庞大，思路又极为相似，因此总结的过程我们只挑选其中最有代表性的成果进行展示。

3.1 circRNA与肿瘤

2018年肿瘤学相关circRNA的报道非常多，涉及的肿瘤类型较以往也有很大的增加。主要的肿瘤类型包括乳腺癌，胶质瘤，肺癌，肝癌，胃癌，结肠直肠癌，胃癌，胰腺癌等等。具体每种肿瘤类型涉及的文章数目已在前面汇总，下面主要挑选其中最有代表性的几项研究工作：

LINC-PINT来源CircRNA编码多肽在胶质瘤中抑制癌基因表达

10月26日，Nature Communications杂志在线发表了中山大学附属第一医院张弩为通讯作者的文章，报道来自LINC-PINT的一种circRNA能够编码一种87aa的多肽，具有抑制胶质瘤发生发展的作用[15]。

本研究前期通过高通量转录组和翻译组测序分析发现长非编码RNA LINC-PINT的2号外显子可单独形成Circ-PINT的环状RNA，Circ-PINT包含一个完整的开放阅读框，可能编码多肽，进一步通过制备针对该多肽的特异性抗体并结合CRISPR/cas9基因敲除细胞株等实验，证实Circ-PINT可通过核糖体进入位点序列IRES翻译出87个氨基酸组成的全新多肽PINT87aa通过结合聚合酶相关因子复合物基因PAF1，抑制多种癌基因的转录延伸，进而抑制恶性胶质瘤的发生和进展，细胞功能实验表明PINT87aa通过结合聚合酶相关因子复合物基因PAF1，抑制多种癌基因的转录延伸，进而抑制恶性胶质瘤的发生和进展，体内动物实验，在小鼠脑部原位以及皮下成瘤实验中过表达PINT87aa蛋白的肿瘤细胞，成瘤能力大大减弱，动物生存期延长，而基因敲除低成瘤细胞中circ-PINT的编码区的部分序列后，动物的成瘤能力得到增强，证实环状RNA circ-PINT翻译的多肽具有抑制肿瘤的作用。该研究结果提示环状RNA编码的多肽产物可能在恶性肿瘤诊断、预后及靶向治疗方面具有重要的研究意义[15]。

图10 LINC-PINT的一种circRNA能够编码多肽 （来自[15]）

circRNA调控细胞自噬

7月4日，Oncogene杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的文章，介绍发现环形RNA circ-Dnmt1 通过调控p53和AUF1入核，促进细胞自噬作用[16]。

Circ-Dnmt1是DNMT1基因第6和7外显子反向拼接形成的，作者是通过芯片分析发现乳腺癌细胞中普遍存在circ-Dnmt1高表达的现象，因此针对该分子的作用机制展开了研究。过表达circ-Dnmt1能促进细胞增殖，并且能增加对应的Dnmt1的成熟的mRNA水平，但对该基因的转录出产物pre-mRNA没有影响。过表达circ-Dnmt1能促进细胞自噬，免疫荧光实验表明p53和AUF1在circ-Dnmt1过表达后核定位增加了，RIP实验证明了circ-Dnmt1可以与p53和AUF1相互作用。核定位的p53促进自噬相关基因的表达，而核定位的AUF1不能继续调控Dnmt1的mRNA降解作用，导致该mRNA富集并促进DNMT1蛋白的表达。小鼠皮下肿瘤模型实验表明过表达circ-Dnmt1显著增加肿瘤的体积[16]。

图11 circ-Dnmt1可与p53和AUF1相互作用 （来自[16]）

乳腺癌中circ-Ccnb1抵消p53突变的效应

5月23日，Nature子刊Cell Death & Differentiation杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的文章，介绍发现乳腺癌中circ-Ccnb1能够抵消p53突变的效应，发挥抑制肿瘤的作用[17]。

circ-Ccnb1由CCNB1基因的第四和第五外显子反向拼接形成，作者发现circ-Ccnb1在乳腺癌中特异性的降低。基于RNA Pull-down筛选相互作用蛋白，最终发现了circ-Ccnb1可以通过H2AX与p53或Bclaf1相互作用相互作用，并且突变型的p53中，circ-Ccnb1可通过H2AX与Bclaf1相互作用，发挥抑癌相关的基因转录功能。体内模型中也证明稳定过表达或直接注射circ-Ccnb1过表达质粒均可显著抑制肿瘤生长，未来或许可以开发出基于circ-Ccnb1的肿瘤治疗策略[17]。

图12 circ-Ccnb1互作蛋白机制 （来自[17]）

circRNA参与启动子表观遗传调控

12月11日，Genome Biology杂志在线发表了吉林大学附属第一医院胡继繁和崔久嵬为共同通讯作者的文章，介绍发现来自FLI1基因的circRNA能参与调控基因启动子的甲基化修饰[18]。

与常规的circRNA研究论文不同，本文作者一开始是希望探索FLI1基因在乳腺癌中表达增高的机制，从FLI1基因的启动子结合分子入手。作者采用了一种基于dCas9（没有内切酶活性的Cas9突变体，依然具有基于gRNA的精确基因组定位功能）的免疫共沉淀分离技术（CasIP），在所钓取的分子中意外发现了来自FLI1基因的由外显子2-4形成的circRNA（作者将其命名为FECR1），作者发现过表达FECR1能促进细胞侵袭。进一步，作者通过RAT分析（基于反转录的分子捕获分析），作者发现了在乳腺癌中受FECR1调控的下游基因，这些基因主要与细胞增殖调控有关。FECR1在FLI1基因的结合位点主要是启动子区的CpG岛，FECR1促进该区域的去甲基化。有趣的是，DNMT1基因也是FECR1的下游基因，但FECR1主要是抑制DNMT1的表达，与此同时，作者还发现TET1也能结合FECR1。这些发现表明FECR1参与了基因的表观遗传调控[18]。

图13 FECR1结合DNMT1启动子，抑制其表达 （来自[18]）

融合基因来源CircRNA具有促癌作用

4月8日，Cell Research杂志在线发表了四川大学华西医院Yong Peng为通讯作者的Letter文章，介绍发现来自融合基因EML4-ALK的环形RNA F-circEA有促进细胞增殖迁移的功能，并且在融合基因EML4-ALK为阳性的NSCLC患者血清中能检测到F-circEA，表明F-circEA有可能作为EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的诊断标志物[19]。与本文类似的，该团队还发现了来自EML4-ALK融合基因的另一种circRNA分子，F-circEA-2a也具有促癌作用，相关工作发表于Molecular Cancer杂志[20]。

融合基因来源的circRNA是高度疾病特异性的分子产物，是最理想的诊断标志物，因此具有非常高的应用价值。本文正是基于这一发现的启发，探索非小细胞肺癌中常见的融合基因EML4-ALK是否会产生circRNA分子。通过在EML4-ALK阳性的细胞株H2228中进行PCR分析，明确了有circRNA的存在，继而分析干扰或过表达F-circEA后对细胞增殖，迁移，克隆形成等功能的影响。由于融合基因作为诊断标志物的独特优势，作者进一步分析了临床上EML4-ALK阳性的患者血液中是否具有可检测的F-circEA，结果表明F-circEA可特异性的在患者血浆中检测到，但对应的EML4-ALK mRNA仅存在于细胞质中，不会游离出来。

图14 F-circEA可存在血浆中 （来自[19]）

3.2 circRNA与心血管疾病

循环系统是除了肿瘤之外circRNA研究最多的方向，2018年心血管相关circRNA的研究报道没有出现爆发式增长，文章数目略有增加，但高分的研究论文偏少。

Circulation Research：

1月12日，Circulation Research杂志在线发表了意大利Humanitas研究医院Gianluigi Condorelli和Leonardo Elia为共同通讯作者的文章，报道Circ_Lrp6通过竞争性结合miR-145在血管平滑肌细胞中发挥功能[21]。

作者基于RNA-seq和生物信息学鉴定发现了血管平滑肌细胞特异性的circRNA分子，其中来源于于脂蛋白受体6（Lrp6）的circRNA分子circ_Lrp6包含了多个miR-145的结合位点，在小鼠和人之间是高度保守。Lrp6在血管中高表达并与血管病变有关。通过RIP，STED超分辨显微镜和竞争性荧光素酶报告基因检测确定了circ_Lrp6与miR-145的相互作用。基于功能损失-恢复的实验设计，作者进一步发现circ_Lrp6阻碍了miR-145介导的VSMC迁移，增殖和分化的调节。 miR-145和circ_Lrp6在鼠和人血管疾病中的差异表达表明，与miR145结合的circ_Lrp6与未结合的比率可能在血管发病机制中起作用。 circ_Lrp6 shRNA的病毒传递阻止了小鼠颈动脉内膜增生[21]。

图15 circ_Lrp6与miR-145共定位 （来自[21]）

3.3 circRNA与其他人类疾病

circHECTD1参与矽肺的病理机制

1月1日，知名杂志Theranostics（影响因子8.854）在线发表了东南大学医学院巢杰教授为通讯作者的文章，介绍发现circRNA参与二氧化硅诱导的矽肺病理机制[22]。

作者通过构建二氧化硅诱导的矽肺小鼠模型筛选相关的circRNA分子，发现circHECTD1在矽肺模型中出现显著的显著下调，该circRNA分子所对应的基因HECTD1已报道参与与矽肺的发生过程，因此本文重点探索该circRNA分子的作用情况。分别分析了体外二氧化硅处理的细胞模型中circHECTD1的表达情况，circHECTD1与巨噬细胞活化通路的关系，相关分子机制的探索以及病人标本中的检测和验证[22]。

图16 circHECTD1作用模式图 （来自[22]）

4. circRNA研究工具与方法进展

4.1 circRNA研究的信息学工具与数据库

《Nucleic Acids Research》发布2018年度数据库专刊

本期共收集了181篇文章，其中84篇为之前曾在数据库专刊中报道过的数据库的更新版，82篇为新收录的，还有15篇为最新上线和公布的数据库。核酸方面的数据库包括用于可视化基因组3D结构和RNA结构的数据的3DIV数据库，RNA家族的分级分类的RNArchitecture数据库。蛋白质数据库包括经典的SMART，ELM和MEROPS，也包括GPCRdb和STCRDab等新面孔。在代谢领域，HMDB和Reactome报道增加了新的功能，PULDB数据库则是首次收录。基因组Resource数据库包括Ensembl，UCSC基因组浏览器和ENCODE。还有其他的药学，蛋白质组学等等不同领域的数据库。

今年的数据库专刊首次收录了两个circRNA相关的数据库：CSCD和exoRBase。CSCD是介绍肿瘤特异性的circRNA表达的数据库。exoRBase是专门收录外泌体中各种RNA分子的数据库，其中包括了circRNA。

CircRNA的计算生物学研究方法汇总分析

1月12日，Cell子刊 Trends in Genetics在线发表了中国科学院北京生命科学研究院的赵方庆教授的综述文章，汇总分析了目前常用的circRNA分析工具[23]。

文中比较了目前常用的测序数据分析方法，测序方案及下游数据分析的工具。

图17 目前11种circRNA鉴定算法精确性比较 （来自[23]）

4.2 circRNA研究的分子细胞生物学技术进展

干扰RNA（siRNA）设计成环形可有助于降低脱靶效应

1月21日，Molecular Therapy Nucleic Acids杂志在线发表了北京大学药学院汤新景教授为通讯作者的文章，报道发现将干扰RNA的一条设计为闭合环状的形态将有助于提高特异性和延长作用能力，降低脱靶效应，预示着未来circRNA或许可以直接成为有效的核酸药物[24]。

脱靶效应一直是干扰RNA有效发挥作用的最大问题之一，本文独辟蹊径，尝试直接将siRNA的一条链设计成环状的形式，另一条链仍为线性（circ-siRNA），预实验结果表明这种形式的siRNA不仅可以有效降低靶mRNA，还能实现链特异性的干扰效果。体内实验也表明circ-siRNA的作用时间更持久。

图18 干扰RNA设计成环形可有助于降低脱靶效应（来自[24]）

《Methods in Molecular Biology》发表circRNA技术方法专刊

著名的方法学杂志《Methods in Molecular Biology》在2018年专门对circRNA的研究方法做了专刊，包含了17篇方法学的文章，涵盖了circRNA分离，验证，分析与功能研究等各个方面。

基于腺相关病毒载体实现体内circRNA表达和翻译蛋白

8月17日，Cell子刊Molecular Therapy: Nucleic Acid （影响因子5.66）在线发表了美国北卡罗来纳大学教堂山分校Aravind Asokan博士为通讯作者的文章， 介绍他们开发了一种基于腺相关病毒载体（rAAV）的体内表达circRNA并实现翻译蛋白的载体工具[25]。

本文的构思比较简单，也证明了基于AAV的体内过表达circRNA并实现翻译蛋白是完全可行的，这一体系对于circRNA研究提供了重要的工具，未来极有可能在circRNA的研究中获得广泛应用。

图19 AAV载体框架示意图 （来自[25]）

基于NanoString nCounter进行circRNA绝对定量

12月，Nature子刊Laboratory Investigation在线发布了一项circRNA的定量分析技术：基于NanoString nCounter 荧光条形码标记检测技术实现circRNA绝对定量分析的[26]。

NanoString nCounter 荧光条形码标记检测技术的原理概括起来就是：针对靶分子设计两个探针：捕获探针和报告探针，捕获探针带生物素标记，报告探针带四色荧光基团，可通过不同的排列组合方式实现标记。检测过程中将总RNA与两种探针杂交，纯化，固定后扫描后得到表达量的结果。从测试的结果来看，该技术的定量效果和检测灵敏度要好于传统的芯片法，与Real-Time PCR相似。

图20 NanoString nCounter技术原理 （来自[27]）

体内通过circRNA稳定表达蛋白的载体系统

7月6日，Nature Communications杂志在线发表了麻省医工学院Daniel G. Anderson为通讯作者的文章，介绍开发了一种借助形成circRNA提高体内蛋白表达水平的新方法[28]。

mRNA一般半衰期较短，这限制了其在体内过表达蛋白的效率。本文作者设计了一种基于circRNA的蛋白过表达体系，通过自剪切的内含子序列实现circRNA的自动高效率生成，然后体外自动产生高质量的circRNA分子，输入体内后实现蛋白过表达[28]。

图21 基于circRNA的体内蛋白过表达体系 （来自[28]）

5. 非医学相关circRNA研究进展

Nrf2敲除小鼠黑质和纹状体中差异表达的circRNA

10月23日，Cellular Physiology and Biochemistry杂志发表了河北医科大学王磊和孙绍光为通讯作者的文章，介绍在Nrf2基因敲除小鼠中探索黑质和纹状体中circRNA表达变化情况[29]。

小鼠胚胎植入前后子宫内膜CircRNA表达分析

10月28日，Journal of cellular physiology发表了重庆医科大学Yingxiong Wang和Rufei Gao为通讯作者的文章，介绍分析了早期妊娠小鼠的胚胎植入前后子宫内膜circRNA的表达变化情况[30]。

这些动物模型的研究相对简单，类似于14年前后在人类疾病中筛选差异circRNA的工作。除了这两篇文章外，2018年在动物模型，动物学和植物学等非人类疾病相关的基础学科方向也有大量文献报道，具体数目见前面的统计表格。因篇幅有限，不在此处列举所有相关文献的信息。

6. circRNA重要综述

Molecular Cell：重要circRNA综述

8月2日，Molecular Cell杂志在线发表了陈玲玲教授和杨力教授为通讯作者的重要circRNA综述，系统汇总了circRNA生成机制，功能模型等方面的研究进展，也剖析了目前circRNA研究所面临的问题[31]。

有关circRNA的专著

Springer出版集团的Advances in Experimental Medicine and Biology第1087期做了circRNA的专题，详细介绍了circRNA生成，功能机制，与疾病的关系等不同方面的汇总整理。

Cell：lncRNA功能分类与研究技术综述

1月25日，Cell杂志发表了德州大学西南医学中心Joshua T. Mendell教授为通讯作者的综述文章，系统阐述了目前关于lncRNA功能的分类及研究方法。

Molecular Cell：陈玲玲教和杨力教授授发表circRNA重要综述

8月2日，Molecular Cell杂志发表了陈玲玲教授和杨力教授为通讯作者的综述文章，系统汇总了circRNA的生成机制和功能机制的研究进展，并分析了目前circRNA研究依然面临的问题。

Frontiers in Immunology：circRNA在肿瘤免疫中的潜在价值

1月22日，中南大学湘雅医院武明花教授在Frontiers in Immunology杂志发表综述文章，分析了circRNA在肿瘤免疫中潜在的功能和价值。肿瘤免疫治疗是当前研究热门，以有许多研究表明lncRNA、miRNA在抗肿瘤免疫反应中起到重要作用，但circRNA在抗肿瘤免疫反应中的研究还不多，该综述回顾了lncRNA、miRNA和circRNA等非编码RNA分子在抗肿瘤免疫反应中的研究进展，并提示circRNA在抗肿瘤免疫治疗中将起到重要作用，肿瘤免疫治疗领域将是circRNA研究的下一个重要方向。

7. circRNA研究总体趋势与未解决的问题汇总分析

2018年circRNA在国家自然科学基金和发表文章方面都取得了不俗的成绩，但依然有很多问题尚未解决，概括而言，circRNA研究仍面临的问题包括：

（1）circRNA的二级结构与功能的关系是怎样的？

（2）除了m⁶A，其他修饰类型是否也可存在于circRNA中？这些修饰的生理病理机制是怎样的？

（3）部分circRNA在多物种间存在保守性，这种保守性的原因是什么？

（4） circRNA相互作用分子的鉴定，什么条件影响了circRNA与其他分子的相互作用？存在动态的相互作用方式吗？

（5）circRNA降解的分子机制是什么？

（6）circRNA进入外泌体可能存在选择性，机制和生理病理意义是什么？

（7）circRNA亚细胞定位的机制是怎样的？

（8）组织/疾病特异性circRNA表达特征是如何形成的？会有多少种机制调控circRNA的形成？

（9） circRNA的敲除模型依然遥不可及，circRNA的组织/细胞条件性表达动物模型是否可行？

（10）人群基因组中经常出现SNP多态性或高度相关的基因区，这些位点或区域与circRNA的关系是怎样的？是否通过circRNA相关的机制发挥作用？

参考文献：

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2. Li, Z., M.G. Kearse, and C. Huang, The nuclear export of circular RNAs is primarily defined by their length. RNA Biol, 2018.

3. Wan, Y. and A.K. Hopper, Size matters: conserved proteins function in length-dependent nuclear export of circular RNAs. Genes Dev, 2018. 32(9-10): p. 600-601.

4. Azmi, A.S., Nuclear export mechanisms of circular RNAs: size does matter. Noncoding RNA Investig, 2018. 2.

5. Chuang, T.J., et al., Integrative transcriptome sequencing reveals extensive alternative trans-splicing and cis-backsplicing in human cells. Nucleic Acids Res, 2018. 46(7): p. 3671-3691.

6. Talhouarne, G.J.S. and J.G. Gall, Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of vertebrate cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(34): p. E7970-E7977.

7. Toptan, T., et al., Circular DNA tumor viruses make circular RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(37): p. E8737-E8745.

8. Kleaveland, B., et al., A Network of Noncoding Regulatory RNAs Acts in the Mammalian Brain. Cell, 2018. 174(2): p. 350-362 e17.

9. Xia, P., et al., A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion. Immunity, 2018. 48(4): p. 688-701 e7.

10. Nicolet, B.P., et al., Circular RNA expression in human hematopoietic cells is widespread and cell-type specific. Nucleic Acids Res, 2018. 46(16): p. 8168-8180.

11. Chen, B.J., S. Huang, and M. Janitz, Changes in circular RNA expression patterns during human foetal brain development. Genomics, 2018.

12. Aufiero, S., et al., Cardiac circRNAs arise mainly from constitutive exons rather than alternatively spliced exons. RNA, 2018. 24(6): p. 815-827.

13. Kaur, S., A.H. Mirza, and F. Pociot, Cell Type-Selective Expression of Circular RNAs in Human Pancreatic Islets. Noncoding RNA, 2018. 4(4).

14. Zaghlool, A., et al., Expression profiling and in situ screening of circular RNAs in human tissues. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 16953.

15. Zhang, M., et al., A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 4475.

16. Du, W.W., et al., A circular RNA circ-DNMT1 enhances breast cancer progression by activating autophagy. Oncogene, 2018. 37(44): p. 5829-5842.

17. Fang, L., et al., Enhanced breast cancer progression by mutant p53 is inhibited by the circular RNA circ-Ccnb1. Cell Death Differ, 2018. 25(12): p. 2195-2208.

18. Chen, N., et al., A novel FLI1 exonic circular RNA promotes metastasis in breast cancer by coordinately regulating TET1 and DNMT1. Genome Biol, 2018. 19(1): p. 218.

19. Tan, S., et al., Circular RNA F-circEA produced from EML4-ALK fusion gene as a novel liquid biopsy biomarker for non-small cell lung cancer. Cell Res, 2018. 28(6): p. 693-695.

20. Tan, S., et al., Circular RNA F-circEA-2a derived from EML4-ALK fusion gene promotes cell migration and invasion in non-small cell lung cancer. Mol Cancer, 2018. 17(1): p. 138.

21. Hall, I.F., et al., Circ_Lrp6, a Circular RNA Enriched in Vascular Smooth Muscle Cells, Acts as a Sponge Regulating miRNA-145 Function. Circ Res, 2018.

22. Zhou, Z., et al., circRNA Mediates Silica-Induced Macrophage Activation Via HECTD1/ZC3H12A-Dependent Ubiquitination. Theranostics, 2018. 8(2): p. 575-592.

23. Gao, Y. and F. Zhao, Computational Strategies for Exploring Circular RNAs. Trends Genet, 2018. 34(5): p. 389-400.

24. Zhang, L., et al., Circular siRNAs for Reducing Off-Target Effects and Enhancing Long-Term Gene Silencing in Cells and Mice. Mol Ther Nucleic Acids, 2018. 10: p. 237-244.

25. Meganck, R.M., et al., Tissue-Dependent Expression and Translation of Circular RNAs with Recombinant AAV Vectors In Vivo. Mol Ther Nucleic Acids, 2018. 13: p. 89-98.

26. Dahl, M., et al., Enzyme-free digital counting of endogenous circular RNA molecules in B-cell malignancies. Lab Invest, 2018. 98(12): p. 1657-1669.

27. Geiss, G.K., et al., Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol, 2008. 26(3): p. 317-25.

28. Wesselhoeft, R.A., P.S. Kowalski, and D.G. Anderson, Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 2629.

29. Yang, J.H., et al., The Differentially Expressed Circular RNAs in the Substantia Nigra and Corpus Striatum of Nrf2-Knockout Mice. Cell Physiol Biochem, 2018. 50(3): p. 936-951.

30. Zhang, S., et al., Altered expression patterns of circular RNAs between implantation sites and interimplantation sites in early pregnant mice. J Cell Physiol, 2018.

31. Li, X., L. Yang, and L.L. Chen, The Biogenesis, Functions, and Challenges of Circular RNAs. Mol Cell, 2018. 71(3): p. 428-442.

PS：由于时间仓促，检索过程中难免有疏漏的项目，所以本文仅供参考，后续我们还将继续全面检索2018年获批的项目明细，到时候一起做出最终的2018年度国家自然科学基金获批情况的报告。

1. 获批circRNA项目数量最多的高校（Top 10）

经过整理，获得circRNA项目最多的申请单位前10位高校列表如下：（含学科分布信息）

2. 肿瘤学方向获批项目特点分析

肿瘤学方向是获批项目最多的学科方向，共有51项获批，下面将依据详细的学科方向汇总获批项目的数目：

消化系统的肿瘤依然是今年circRNA项目获批最多的学科单项。其他肿瘤学相关方向也获得了一定的进展

3. 其他主要获批学科方向

2018年医学方向除肿瘤学之外其他多种学科方向也都有circRNA的研究获得资助。其中循环系统circRNA研究获批16项，生殖系统/围生医学/新生儿学科方向获批7项，等等。详见后附目录。生命科学方向总体获批项目数目不多，可能与circRNA相关的基础研究难度较大有一定关系。

附：2018年获批国家自然科学基金信息列表

3.1 circRNA相关数据库

3.2 circRNA相关信息学分析工具

3.3 circRNA研究的分子细胞生物学技术进展

4. 非医学相关circRNA研究进展

4.1 植物学领域circRNA进展

4.2 动物学领域circRNA进展

5. circRNA重要综述

6. circRNA研究总体趋势与未解决的问题汇总分析

6.1 circRNA相关国家自然科学基金

6.2 circRNA仍未解决的问题汇总

参考文献

3. circRNA研究工具与方法进展

要开展circRNA研究离不开有效的研究方法和工具，经历了多年的发展，已经积累了很多非常有效的研究工具和方法，2017年在circRNA研究工具和方法方面也取得了长足发展，包括相关的数据库工具，信息学分析工具以及生化和分子细胞生物学技术等等，下面分别详述：

3.1 circRNA相关数据库

CSCD：肿瘤特异性circRNA数据库

9月28日，Nucleic Acids Research杂志在线发表了武汉大学何春江教授和UT health Science Center韩冷教授为共同通讯作者的文章，介绍发布一个全新的肿瘤特异性circRNA数据库：CSCD（cancer-specific circRNA database[41]，网址：http://gb.whu.edu.cn/CSCD）。

CSCD数据库从ENCODE中收集了19种肿瘤类型的87种细胞系及141种正常细胞的circRNA数据，构建了该数据库。总共汇总得到了272152种肿瘤特异性的circRNAs，950962种正常细胞特异的circRNAs，还有170909种为肿瘤和正常样本共有的。共收集了1394023种circRNA分子，其中外显子来源759039种，内含子来源436668种，基因间序列来源122806种。来自mRNA的1153542种，来lncRNA的42165种。预测到了MRE 76439955个，RNA结合蛋白结合位点103927037个，ORF 3462097个[41]。

图41 CSCD数据库概览（来自[41]）

exoRBase：外泌体长链RNA数据库

10月9日，Nucleic Acids Research杂志（IF ₂₀₁₆= 10.16）在线发表了复旦大学医学院上海肿瘤研究所黄胜林教授为通讯作者的文章，公布他们开发的专门收录外泌体中各种长链RNA（mRNA, lncRNA及circRNA）的数据库：exoRBase[42]。数据库连接：http://www.exoRBase.org

exoRBase数据库共收录了58330种circRNAs，15501种lncRNAs，18333种mRNAs，它们来自92份血清外泌体RNA-seq测序样本。作者还依据GTEx project获得组织特异性RNA表达特征，分析了相关RNA分子的组织来源。数据库收录的样本包括健康对照者32例，冠状动脉心脏疾病（CHD）6例，结肠癌（CRC）12例，肝细胞癌（HCC）21例，胰腺腺癌（PAAD）14例，乳腺癌2例[42]。

图42 exoRBase数据库概览（来自[42]）

circlncRNAnet：整合lncRNA和circRNA的功能网络的在线分析数据库：

11月29日，Gigascience杂志在线发表了台湾长庚大学医学院Bertrand Chin-Ming Tan为通讯作者的文章，介绍一种整合的circRNA分析数据库：circlncRNAnet[43]。

circlncRNAnet 在线数据库由我国台湾科学家创建的关于lncRNA和circRNA功能研究的数据库，本人试用后发现该数据库非常实用，对科研课题的数据挖掘可以起到事半功倍的作用，是近年来ncRNA领域不可多得的在线友好数据分析工具。总结起来该数据库主要有如下三大优点：用户可提交分析自己的lncRNA和circRNA芯片或测序的表达数据；整合了TCGA数据库20多个肿瘤类型数据，无需编程实现在线可视化分析；分析模块非常丰富，包括lncRNA组织表达热图、箱线图、共表达散点图、circos图，基因功能富集分析GO和KEGG图，还有RBP-RNA结合蛋白网络图，miRNA网络图等[43]。具体网站链接http://app.cgu.edu.tw/circlnc/

图43 CirclncRNAnet数据库设计及分析流程示意图 （来自[43]）

3.2 circRNA相关信息学分析工具

circRNA检测工具系统评价

6月8日，PLoS Computational Biology杂志在线发表了天津大学计算机科学与技术学院邹权教授为通讯作者的综述文章，汇总和比较了目前主要的circRNA分析相关技术的优势与不足[44]。

文中比较了目前已报道的常用的分析circRNA的11种工具，比较了它们在精度，灵敏度，F1 Score，AUC值（Area under Precision-Recall Curve），运行时间及物理存储空间需求等指标的情况，没有一种工具是所有指标都表现的异常出色的[44]。换言之，这11种分析方法表现为各有所长，在具体应用的时候还是需要根据需求灵活选择最合适的工具。最终作者认为CIRI、CIRCexplorer和KNIFE的各方面性能得到了最大程度的平衡是常规环形RNＡ分析工具的首选[44]。

图44 各种circRNA分析工具（来自[44]）

circRNA二级结构预测算法

2月20日，Journal of Theoretical Biology杂志在线发表了西班牙萨拉戈萨生物计算和物理复杂系统研究所Jose A. Cuesta为通讯作者的文章，介绍分析circRNA二级结构的研究工作[45]。与所对应的线性RNA不同，circRNA存在拓扑张力的问题，且不存在线性RNA那样的预测起点（circRNA的每个碱基都是等效的），因此circRNA的二级结构分析预测的方法与线性RNA有所差别，本文对circRNA二级结构预测算法做了分析。

circScan分析circRNA相互作用蛋白

3月11日， 著名预印本杂志BioRxiv在线发表了中山大学屈良鹄教授和杨建华教授为共同通讯作者的文章。介绍利用circScan分析circRNA相互作用蛋白的技术[46]。

作者开发了一种全新的分析circRNA相互作用蛋白的技术体系，称为circScan，主要是基于交联技术将互作蛋白钓取的RNA进行深度测序（CLIP-Seq），找出包含反向拼接的Reads。利用该技术流程，作者在人的样品中发现了12540种circRNA-蛋白相互作用，小鼠中发现了1090种。有趣的是，作者发现了一些circRNA与eIF3相互作用，这是一种5’-帽子不依赖的蛋白翻译起始因子，也发现了circRNA具有m⁶A修饰的情况[46]。这与其他文献报道的发现吻合。

图45 circScan流程分析蛋白-circRNA相互作用（来自[46]）

其他circRNA相关分析工具方法报道：

3.3 circRNA研究的分子细胞生物学技术进展

Cas9同源蛋白Csy4促进circRNA生成

2月21日，RNA杂志在线发表了北卡大学教堂山分校Aravind Asokan教授为通讯作者的文章，介绍开发了一种基于CRISPR同源蛋白Csy4的促进RNA环化的技术[47]。

Csy4是CRISPR家族的一个Cas-9的同源蛋白，有时也被称为Cas6f具有核酸内切酶的功能，在将RNA分子切割后可使5’端切割后的产物更稳定。基于这一特性，作者设计了一种表达circRNA的体系，概括而言，就是在内含子中插入Csy4的识别序列，共表达Csy4后该序列下游的RNA序列被切割后降解掉，上游的序列得以稳定存在，促进了环化效率。该方法或许有助于提高circRNA表达的效率和特异性，减少线性RNA副产物。值得引入circRNA过表达体系中[47]。

图46 Csy4可以结合在RNA3’端并稳定RNA分子，促进circRNA的生成（来自[47]）

circRNA制备新技术体系

4月11日，Nucleic Acids Research杂志在线发表了NIH 的Amaresh C. Panda和Kotb Abdelmohsen为共同通讯作者的文章，介绍开发了一种提高circRNA获得效率的新技术[48]。

作者报道的该技术体系在常规的RNase R消化的基础上增加了去除Poly(A)的操作，可大大提高去除线性RNA的效率，作者将该技术称为（RNase R treatment followed by Polyadenylation and poly(A)+ RNA Depletion，RPAD）。基于该技术，作者发现了大量新的内含子来源的circRNA[48]。

图47 RPAD技术流程（来自[48]）

基于tRNA的circRNA表达体系

4月13日，RNA Biology杂志在线发表了北卡罗莱纳大学教堂山分校A. Gregory Matera教授为通讯作者的综述文章，介绍一种基于tRNA剪接作用的circRNA表达策略[49]。

去年A. Gregory Matera教授就曾在酶学方法杂志发表过改技术方法的文章。本文主要分析了古生物和动物中tRNA内含子来源的circRNA，以及借助该体系开发circRNA表达系统[49]。

图48 两种不同的体内circRNA表达系统（来自[49]）

诱导表达circRNA体系

8月2日，方法学杂志Methods in Molecular Biology发表了宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Deirdre C. Tatomer、Dongming Liang和Jeremy E. Wilusz撰写的方法学文章，介绍一种可诱导表达的circRNA体系[50]。大致设计思路是将要表达的circRNA序列克隆至包含反向互补序列的表达载体中，两侧为内含子序列。该RNA分子是诱导表达的，在加入诱导剂后可自动转录产生线性RNA初产物，后由两侧的反向互补序列介导环化作用。

定量蛋白组学分析肝细胞癌中CDR1as的作用网络

9月11日，Journal of Proteome Research杂志（IF 2016=4.268）在线发表了中科院武汉水生生物所葛峰教授为通讯作者的文章，介绍在HCC细胞系中过表达CDR1as后定量蛋白质组学分析[51]。

作者在HepG2细胞中过表达CDR1as，然后进行定量蛋白质组学分析，共测到330种差异表达蛋白（DEPs），通路分析表明大部分与细胞增殖和周期调控有关。也佐证了CDR1as对miR-7的调控作用，例如EGFR是miR-7的下游分子，过表达CDR1as后EGFR出现上调。本文首次利用定量蛋白质组学分析过表达circRNA后细胞变化情况，值得借鉴。

图49 定量蛋白质组学分析CDR1as过表达后蛋白变化 （来自[51]）

circRNA-蛋白相互作用研究进展

9月26日，Theranostics杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的综述文章，系统汇总了截至目前circRNA与蛋白相互作用的研究进展[52]。文中作者系统分析回顾了circRNA-蛋白相互作用的研究进展，主要研究技术及这种相互作用的生理意义。circRNA-蛋白相互作用会对彼此都产生一定的影响，circRNA的存在可以调控蛋白的定位等状态，蛋白与circRNA的结合也会影响circRNA的生成等过程。这初步说明circRNA-蛋白相互作用是非常重要的细胞调控机制，目前的研究还处于早期，非常值得深入探索。

基于数字PCR进行circRNA的绝对定量分析

2017年共有两篇文章报道基于微滴式数字PCR进行circRNA绝对定量的分析研究。其中一篇是宁波大学医学院郭俊明教授于11月2日在线发表于Journal of Molecular Medicine杂志的文章，介绍基于微滴式数字PCR分析胃癌血浆中circRNA的测定[53]。

微滴式数字PCR（ddPCR）是最近兴起的可绝对定量的PCR技术，本文作者首次将微滴式数字PCR应用于circRNA的绝对定量。作者利用ddPCR分析了胃癌患者血液中circRNA的变化情况，通过与疾病特征的相关性分析，最终表明Hsa_circ_0001017和 hsa_circ_0061276可以作为胃癌有效的诊断标志物[53]。

图50 ddPCR检测circRNA （来自[53]）

另一篇是第二军医大学附属长海医院Qing Jing于11月7日在线发表于Biotechnology & Biotechnological Equipmen杂志的文章[54]。

circRNA在单细胞间表达的异质性

10月31日，Scientific Reports在线发表了华中科技大学宁康为通讯作者的文章，介绍基于单细胞测序，分析了细胞之间circRNA的异质性表达特征[55]。作者利用单细胞测序的方法分析了HEK293不同细胞之间circRNA的表达差异情况，结果表明细胞之间circRNA的表达存在一定程度的异质性。

uvCLAP用于circRNA蛋白相互作用分析

7月1日，预印本杂志BioRxiv在线发表了德国弗莱堡弗赖堡大学计算机科学系生物信息学组Rolf Backofen和马普学会免疫生物学和表观遗传学研究所Asifa Akhtar为共同通讯作者的文章，介绍基于uvCLAP分析蛋白与RNA相互作用的技术，其中包括了circRNA的分析[56]。

4. 非医学相关circRNA研究进展

除了医学方向，2017年在非医学方向circRNA的报道也出现一定程度增长态势，主要分为植物学和动物学两个领域。

4.1 植物学领域circRNA进展

拟南芥中发现circRNA调控RNA剪接作用

4月18日，Nature Plants杂志在线发表了法国格勒诺布尔-阿尔卑斯大学Simon J. Conn教授为通讯作者的文章，介绍在拟南芥中发现SEPALLATA3（SEP3）基因来源的circRNA形成R-loop调控同源mRNA的剪接过程[57]。

本中作者探索了拟南芥中发现SEPALLATA3（SEP3）基因第六外显子形成的circRNA对所对应的同源mRNA剪接作用的影响，该circRNA能够稳定结合所对应的DNA序列，形成RNA:DNA杂交体，导致转录暂停，募集RNA拼接因子，形成可变剪切[57]。

图51 SEP3基因第六外显子形成的circRNA调控RNA拼接过程（来自[57]）

植物类病毒突变率分析

9月14日，PLoS Pathogens杂志在线发表了西班牙瓦伦西亚大学Rafael SanjuaÂn为通讯作者的文章，介绍基于高保真深度测序分析叶绿体与核中类病毒的自发突变率[58]。类病毒基因组为单链环形RNA分子，本文作者挑选了两种类病毒进行分析，一种是定位于叶绿体的简写为ELVd的类病毒，另一个是定位于细胞核的简写为PSTVd的类病毒。结果表明ELVd的突变率高于PSTVd。

其他植物学相关circRNA研究报道：

4.2 动物学领域circRNA进展

小鼠中风模型中circRNA表达特征分析

7月12日，Stroke杂志在线发表了威斯康星大学麦迪逊分校Raghu Vemuganti教授为通讯作者的文章，介绍在小鼠缺氧中风模型中伴随时间变化，circRNA表达特征的研究工作[59]。

作者在基于大脑中动脉栓塞构建的小鼠中风模型中分析了6，12和24小时后半暗带皮质中circRNA的表达特征。实验基于芯片法分析，共获得了1320多种circRNA，其中1064种来源于外显子。283种在至少一个时间点表现出差异表达，16种在三个时间点都有同样趋势的变化[59]。本文是首次探索中风模型中circRNA的变化情况，从实验结果来看，circRNA的表达明显受到生理或病理刺激因素的影响。但美中不足的是，本文是基于芯片法分析的，并未针对各种circRNA所对应的线性RNA产物和转录本的表达变化进行分析，如果能找出伴随中风症状而特异性改变的circRNA或许更有意思。

图52 小鼠中风模型中circRNA差异表达分析（来自[59]）

牛成肌细胞分化相关circRNA研究

10月26日，Cell Death & Disease杂志在线发表了西北农林科技大学陈宏教授为通讯作者的文章，介绍发现circLMO7参与调控牛的成肌细胞分化作用[60]。

作者挑选了胎牛和成年牛的肌肉组织进行RNA-Seq分析，共得到了12981种circRNA分子，其中还有530种为携带内含子的circRNA（ciRNA）。作者也针对所得到的circRNA分子进行了基因组定位，分子大小，包含的外显子情况等参数进行了汇总比较。相对于胎牛肌肉组织，circLMO7是下调最明显的circRNA分子之一。作者针对该分子做了一系列的生信分析和相关实验分析。

图53 牛成肌分化中circRNA变化情况 （来自[60]）

其他动物学相关circRNA报道：

5. circRNA重要综述

随着circRNA研究的不断深入，circRNA相关的综述文章也呈现递增趋势，2017年也有多篇重量级的综述文章发表，包括Nature Review Neuroscience杂志等等。

Nature Review Neuroscience：非编码RNA在神经退行性疾病中的作用

8月7日，Nature Review Neuroscience杂志在线发表了比利时VIB脑病研究中心Evgenia Salta和Bart De Strooper共同撰写的综述文章，系统汇总了神经退行性疾病中非编码RNA的作用研究进展。其中有较大的篇幅论述了circRNA在神经退行性疾病中的研究情况[61]。主要包括CDR1as竞争性结合miR-7与神经系统的关系，circ-ANRIL在AD疾病表观遗传方面的作用等。

Nature Immunology：LncRNA与免疫信号通路的关系

8月21日，Nature子刊 Nature Immunology在线发表了斯坦福大学医学院Howard Y Chang教授为通讯作者的文章，系统汇总了lncRNA与免疫信号的关系研究进展，其中较大的篇幅涉及到了circRNA[62]。其中包括circRNA竞争性结合miRNA的作用机制，circRNA参与调控基因转录等作用机制与免疫信号的关系，还特别提到了Howard Y Chang教授今年6月15日在Molecular Cell杂志发表过的外源表达circRNA促进细胞免疫信号激活的文章[63]。

Theranostics：circRNA与肿瘤关系

7月22日，Theranostics在线发表了昆明医科大学附属第三医院杨祚璋和谢琳为共同通讯作者的综述文章，汇总了circRNA与肿瘤的关系研究进展[64]。文中较系统的汇总了circRNA形成机制，在不同肿瘤中的研究进展以及作为肿瘤标志物的研究进展。

肿瘤中可变剪切综述

9月14日，Seminars in Cell & Developmental Biology杂志（IF 2016=6.614）在线发表了中科院计算生物学研究所王泽峰教授与Song Xiaowei为共同通讯作者的综述文章，汇总介绍了肿瘤中可变剪切与肿瘤机制的关系及在肿瘤治疗中可能的价值[65]。

Oncogene发表重要circRNA综述

10月9日，Oncogene杂志（IF 2016= 7.519）在线发表了丹麦奥胡斯大学Lasse Sommer Kristensen 教授为通讯作者的综述文章，著名RNA研究专家Jørgen Kjems教授也是本文的共同作者之一[66]。

本文中作者系统汇总了目前关于circRNA研究的主要进展，重点汇总了circRNA作为肿瘤标志物的进展，还针对circRNA的功能研究，将可能具有抑癌基因特征和癌基因特征的circRNA分子进行了简单的分类。关于今后circRNA研究需要解决的问题，文章给出了非常中肯的建议，其中包括circRNA的标准化命名问题，肿瘤特异性circRNA表达特征形成的机制，circRNA的修饰等问题。提高RNA-seq的样品制备质量和分析精度也是需要继续改进的方向。

图54 可作为肿瘤标志物的circRNA分子 （来自[66]）

自噬相关非编码RNA综述

4月25日，知名杂志Autophagy在线发表了哈尔滨医科大学肿瘤医院Xu Shouping和Pang Da为共同通讯作者的综述文章，系统汇总了自噬过程中非编码RNA的作用[67]。

本中系统汇总了与自噬过程有关的非编码RNA研究进展，包括lncRNA，miRNA以及circRNA。在此基础上基于信息学的通路分析和进化分析，形成了与自噬有关的非编码RNA作用网络[67]。

图55 不同物种自噬相关miRNA等非编码RNA作用网络（来自[67]）

其他circRNA相关综述列表：

6. circRNA研究总体趋势与未解决的问题汇总分析

6.1 circRNA相关国家自然科学基金

circRNA研究领域在2017年获批项目情况有了巨大的飞跃，经严格统计汇总，2017年国家自然科学金获批的项目中circRNA研究相关的项目总数高达176项，其中包括了两项杰出青年基金，一项优秀青年基金，两项重点项目，94项面上项目，62项青年基金项目，15项地区科学基金项目。

从2017年获批的circRNA项目可以总结出目前circRNA研究的总体特征：

（1） 肿瘤学和循环系统方向是目前circRNA研究最好活跃的学科方向。

（2）circRNA研究已实现从转录组学筛选向特定功能性circRNA机制研究的转变。

（3）circRNA与microRNA相互作用关系是目前最常见的circRNA功能研究思路，未来其他circRNA功能模型的探索会越来越受到重视。

（4）circRNA如何发挥生物学功能的基础研究仍面临不小的挑战，探索开发有效的分析RNA与其它分子相互作用研究工具是打破circRNA功能研究瓶颈的关键。

6.2 circRNA仍未解决的问题汇总

刚刚结束的2017年是不平凡的一年，circRNA在这一年里取得了非常大的进展，一些科学假设被逐渐证实，包括circRNA可直接翻译多肽，circRNA存在m⁶A修饰等等。但科学问题具有迭代的特征，旧问题解决之后一定会伴随产生新的问题，总结而言，circRNA依然面临如下基本问题：

（1）circRNA与所在基因的互作机制是怎样的？转录水平，转录后水平等不同层次的相互关系是怎样的？

（2）除了m⁶A，其他修饰类型是否也可存在于circRNA中？这些修饰的生理病理机制是怎样的？

（3）circRNA的二级结构与功能的关系是怎样的？

（4）circRNA的翻译效率往往低于liner RNA，这是自然选择的结果？还是仍在进化的机制？为什么ciRS-7，SRY等基因会选择主要以环形RNA的形式存在？

（5）竞争性结合miRNA是最容易入手的机制研究模型，但如何更严谨的证明circRNA与miRNA的相互作用还需要进一步完善。

（6）circRNA进入外泌体可能存在在选择性，机制和生理病理意义是什么？

（7）circRNA亚细胞定位的机制是怎样的？

（8）组织/疾病特异性circRNA表达特征是如何形成的？会有多少种机制调控circRNA的形成？

（9）能否实现circRNA的超高分辨率光学成像，活细胞成像或动物体内成像？以更接近生理状态的条件下分析其分布和功能。

（10）人群基因组中经常出现SNP多态性或高度相关的基因区，这些位点或区域与circRNA的关系是怎样的？是否通过circRNA相关的机制发挥作用？

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2. 888集团官网游戏 相关性研究进展

2.1 circRNA与肿瘤

2.2 circRNA与心血管疾病

2.3 circRNA与其他人类疾病

2. 888集团官网游戏 相关性研究进展

888集团官网游戏 的相关性一直是研究的重点领域，以肿瘤学为代表，2017年循环系统相关的研究也表现出迅速增长的态势。疾病相关性的研究大致思路相似，主要是首先基于高通量分析（二代测序或芯片法分析），找出疾病相关的特异性circRNA分子，然后预测分析其可能相互作用的miRNA分子和网络，进行通路分析。严谨的实验会基于各种验证实验对所提出的模型进行相关验证分析。

2.1 circRNA与肿瘤

肿瘤学依然是circRNA研究的主要阵地，在传统的思路基础上，2017年的肿瘤学相关报道也发生了一定的变化，主要体现为特定circRNA的研究报道明显增多，竞争性结合miRNA分子不仅仅局限在生物信息学预测，还增加了实验验证。由于肿瘤学是个非常庞大的领域，按照不同种类的肿瘤，细分如下：

2.1.1 肝癌相关circRNA研究进展：

Hepatology杂志报道CircMTO1在肝细胞癌中的作用机制

5月18日，国际肝脏学杂志顶尖Hepatology杂志在线发表了曹雪涛院士的研究论文，介绍肝癌中环形RNA的研究工作，介绍发现了环形RNA CircMTO1通过竞争性结合miR-9抑制肝细胞癌增殖[21]。曹雪涛院士和第二军医大学于益芝教授为共同通讯作者。

首先，本文揭示的circMTO1在HCC中表达特征非常显著，且与肿瘤的预后相关性很强，具有非常重要的临床研究和应用价值。意义大价值高的东西更容易受到优秀杂志的青睐。其次，本文提出的分子机制证据充分，论证严谨。本文发现的circMTO1竞争性结合miR-9的分子机制模型经过了反复的论证，RIP实验和FISH实验非常有力的支持了circMTO1竞争性结合miR-9的结论，后续在细胞和动物模型的实验也很好的支持了circMTO1通过竞争性结合miR-9发挥对肿瘤的影响的假设 [21]。本文所展示的实验结果严谨而有力，不拖泥带水，简洁明了而又强有力的论证了所提出的机制模型，在已发表的miRNA Sponge功能模型的文章中也是比较难得的。清晰有力的逻辑论证也是本文的一大亮点，这也是高水平杂志能认可该工作的一个重要原因。

图21 circMTO1的肿瘤内沉默促进体内HCC的生长（来自[21]）

RNAZKSCAN1与circZKSCAN1以不同方式抑制肝细胞癌增殖和迁移

2月16日，Molecular Oncology杂志在线发表了中山大学附属第三医院刘波和杨扬为共同通讯作者的文章，介绍发现ZKSCAN1基因和它的circRNA产物circZKSCAN1以不同方式抑制肝细胞癌增殖和迁移[22]。

文中作者在102例肝细胞癌临床标本中分析了ZKSCAN1与circZKSCAN1的表达情况，发现癌组织中两种RNA分子均降低，两种分子过表达后均抑制肝细胞癌增殖和迁移，RNA-Seq结果表明两种分子的作用机制有所差别[22]。

图22 ZKSCAN1与circZKSCAN1以不同机制发挥作用（来自[22]）

其他肝癌相关circRNA研究报道

2.1.2 胃癌相关circRNA研究进展：

胃癌中circLARP4竞争性结合miR-424-5p调控LARP4的表达

9月11日，Molecular Cancer杂志在线发表了上海交通大学第六人民医院朱金水教授为通讯作者的文章，介绍发现胃癌中circLARP4通过竞争性结合miR-424-5p调控LARP4的表达[23]。

文章作者曾报道LATS1基因在Hippo通路中的作用，在胃癌中LATS1起到类似抑癌基因的作用。本文中作者首先分析了miR-424-5p与LATS1在胃癌中的表达关系以及与临床信息的对应关系，证明miR-424-5p与LATS1的表达量存在负相关。miR-424-5p表达越高，LATS1表达就越低，所对应的胃癌分级就越高，预后也越差。进一步的研究证明miR-424-5p可直接调控LATS1的表达。由于大量的文献报道表明circRNA可以通过竞争性抑制miRNA发挥作用，因此作者基于circRNA表达谱分析，circBase数据库检索及miRNA作用位点分析软件综合分析后筛选出了30种候选circRNA分子。由于胃癌中miR-424位高表达，因此作者挑选15种低表达的circRNA分子进行下一步分析，其中只有来源于LATS1基因第9,10外显子的circRNA（circLARP4）最符合要求。后续实验证明了circLARP4竞争性结合miR-424-5p，所用的实验技术包括双荧光素酶报告系统，RIP实验，FISH等。

图23 胃癌中circLARP4的作用机制（来自[23]）

其他胃癌相关circRNA研究报道：

2.1.3 膀胱癌相关circRNA进展报道

circHIPK3在膀胱癌中竞争性抑制miR-558

8月9日，EMBO Reports杂志在线发表了华中科技大学同济医学院曾甫清教授和蒋国松教授为共同通讯作者的文章，介绍发现膀胱癌中circHIPK3通过竞争性结合miR-558抑制乙酰肝素酶表达[24]。

作者利用RNA-Seq分析了膀胱癌中circRNA差异表达的情况，共得到6154种差异表达的circRNAs，其中circHIPK3显著低表达。过表达实验表明circHIPK3可明显抑制膀胱癌细胞系的增殖和迁移。分子机制方面，作者利用了miRanda、PITA和RNAhybrid三种工具预测了可能相互作用的miRNA，比对分析后找出了12种完全重叠的miRNA分子。然后又通过RNA Pull-down实验证明了miR-558与circHIPK3有相互作用，荧光原位杂交实验进一步验证了这一相互作用[24]。

图24 circHIPK3竞争性结合miR-558（来自[24]）

circRNA MYLK作为内源竞争性RNA在膀胱癌在发挥重要作用

7月4日，Cancer Letters杂志在线发表了重庆医科大学陈俊霞教授为通讯作者的研究论文，介绍发现circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2信号通路促进膀胱癌发生发展[25]。文章通过严谨的实验有力地论证了circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2通路促进BC的发生发展，是一篇难得的miRNA sponge功能模型的文章。

作者利用微阵列芯片分析了4对人膀胱癌（BC）标本的癌及癌旁组织，发现circRNA MYLK与VEGFA在癌组织中共同高表达。然后通过扩大组织标本数量，与临床症状相关性分析等，表明circRNA MYLK可促进膀胱癌发生发展。然后基于预测和验证实验，最终阐明了circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2通路促进膀胱癌的发生发展[25]。

图25 circRNA MYLK的筛选及其与VEGFA的关系（来自[25] ）

CircRNA在膀胱癌早期诊断中的研究

11月28日，新开放的Nature子刊npj Genomic Medicine在线发表了丹麦奥胡斯大学Jakob Skou Pedersen教授和Trine Line Hauge Okholm教授为共同通讯作者的文章，介绍在膀胱癌中筛选circRNA的工作，Jørgen Kjems教授为共同作者[26]。

本文作者从早期的膀胱癌角度出发，考察circRNA是否可以作为膀胱癌潜在的临床诊断标记物，收集了457个NMIBC（(348Ta和109T1）非肌层浸润性膀胱癌标本进行全转录组高通量测序分析。鉴定出15223个circRNAs分子，设定阈值筛选出279个高表达的circRNAs分子进一步与临床特征进行关联分析，发现13个circRNAs与膀胱癌的进展存在相关性，可以作为潜在的诊断分子指标[26]。

图26 膀胱癌相关circRNA筛选鉴定 （来自[26]）

其他膀胱癌相关circRNA研究报道：

2.1.4 结肠直肠癌相关circRNA进展报道

circRNA CCDC66促进结肠癌增殖和转移

3月1日，Cancer Research杂志在线发表了台湾国立成功大学Shaw-Jenq Tsai博士和H. Sunny Sun博士为共同通讯作者的文章，介绍发现circRNA CCDC66促进结肠癌增殖和转移[27]。

文章作者首先通过测序筛选结肠癌相关的circRNA，作者挑选了circCCDC66进行深入探索分析。发现circCCDC66能促进结肠癌细胞增殖和迁移。在结肠癌中circCCDC66过表达，并与结肠癌的临床症状表型有相关性[27]。

图27 circCCDC66促进结肠癌增殖和转移（来自[27]）

其他结肠直肠癌相关circRNA研究报道

2.1.5 其他类型肿瘤相关circRNA进展报道

胶质瘤中circRNA circ-TTBK2作用机制

2月20日， Journal of Hematology & Oncology杂志在线发表了中国医科大学附属盛京医院刘云会教授为通讯作者的文章，介绍关于在胶质瘤中circRNA circ-TTBK2作用机制的研究[28]。

文章发现胶质瘤中circ-TTBK2上调而线性基因没有明显改变。过表达circ-TTBK2促进细胞增殖和迁移并抑制凋亡作用。与此同时，作者发现miR-217在胶质瘤中下降。进一步，作者发现circ-TTBK2可以作为miR-217的miRNA Sponge但线性的TTBK2没有这种作用。强制表达miR-217可抵消circ-TTBK2的作用[28]。

图28 胶质瘤中circRNA circ-TTBK2作用机制 （来自[28]）

口腔癌中circRNA_100290竞争性结合miR-29家族发挥作用

4月3日，Nature子刊Oncogene在线发表了湘雅二院L Chen为通讯作者的文章，介绍发现circRNA circRNA_100290通过竞争性结合miR-29家族分子在口腔癌中的作用[29]。

在本中，作者通过芯片法分析了口腔癌和癌旁组织中circRNA的表达情况，发现了circRNA circRNA_100290与CDK6均在口腔癌中高表达。干扰circRNA_100290后CDK6表达也下降，且细胞增殖受到抑制。进一步通过荧光素酶报告系统，作者发现了circRNA_100290可以通过竞争性结合miR-29家族的分子发挥作用[29]。

图29 circRNA_100290通过竞争性结合miR-29家族分子在口腔癌中的作用（来自[29]）

环形RNA 作为新型的乳腺癌诊断标志物

4月21日，Oncotarget杂志在线发表了南京医科大学王建明教授为通讯作者的文章，介绍一项在乳腺癌中开展的环形RNA差异表达分析，验证及疾病相关性分析的工作[30]。

本中作者共鉴定到1155种差异表达的环形RNA，其中715种上调。进一步鉴定后表明 hsa_circ_103110、 hsa_circ_104689 和hsa_circ_104821明显上调，而hsa_circ_006054、 hsa_circ_100219和 hsa_ circ_406697明显下调。最后在疾病相关性分析中发现联合 hsa_circ_006054、hsa_circ_100219 和 hsa_circ_406697后ROC曲线的AUC值能达到0.82，可作为有效的乳腺癌疾病诊断标志物[30]。

图30 三种环形RNA联合作为乳腺癌诊断标志物（来自[30]）

下咽鳞状细胞癌中差异表达环形RNA鉴定分析

4月27日，Oncotarget杂志在线发表了山东大学齐鲁医院耳鼻喉科潘新良主任和雷大鹏主任为共同通讯作者的文章，介绍一项在下咽鳞状细胞癌中环形RNA的研究工作[31]。

作者通过环形RNA芯片在4例下咽鳞状细胞癌（HSCC）和对应的癌旁组织中筛选分析差异表达的环形RNA，共得到2392种差异表达的环形RNA，其中1304种为上调。接下来作者又在32例标本中验证了所筛选到的差异最大的各10种环形RNA。作者也针对这些差异表达的环形RNA进行了竞争性结合miRNA预测和通路预测分析。

图31 下咽鳞状细胞癌中差异表达的环形RNA（来自[31]）

ANRIL在黑色素瘤中存在多种Isoform形式

6月27日，International Journal of Molecular Sciences杂志在线发表了新西兰奥克兰大学Graeme J. Finlay教授和Marjan E. Askarian-Amiri教授为共同通讯作者的文章。介绍发现在黑色素瘤中非编码RNA基因ANRIL存在多种Isoform形式，其中也包括circRNA[32]。

有报道表明非编码RNA 基因ANRIL的剪切方式存在组织特异性的特征，但有关该基因的剪切方式还缺少系统性的研究。本文作者选择两株黑色素瘤细胞进行分析，发现了ANRIL的剪切方式存在细胞类型特异性，也发现了该基因对应的circRNA。线性的ANRIL的主要定位于核内，而circ-ANRIL定位于胞质[32]。

图32 ANRIL功能通路（来自[32]）

白血病中MYC扩增区对circRNAs表达影响

11月28日，Leukemia杂志在线发表了意大利巴里奥尔多大学生物系Clelia Tiziana Storlazzi教授为通讯作者的文章，介绍在急性髓系白血病（AML）中Myc的基因组结构，进化和转录影响[33]。

急性髓性白血病AML基因组通常不稳定存在均质染色区（homogeneously staining regions，HSR）和双微体（double minutes，DMs）等基因扩增区域，本文研究者着重研究了白血病染色体8q24区域发现了MYC双微体扩增区，同时也发现环形RNA circPVT1的异常扩增，表明双微体扩增可引起circRNAs表达异常。作者收集了20例 AML基因组扩增样本，采用illumina的TruSeq捕获试剂盒捕获8q22.3-24.1区域进行RNA-seq检测，考察该区域基因表达情况[33]。

图33 CircPVT1在8q24区域同样异常高表达 （来自[33]）

其他类型肿瘤相关circRNA研究报道：

2.2 circRNA与心血管疾病

循环系统在2017年度circRNA研究报道出现爆发式增长，多篇高水平研究论文发表，从国家自然科学基金的受理情况来看，也是仅次于肿瘤学的重要领域方向。

circRNA参与平滑肌α-actin基因表达调控

7月11日，知名杂志Circulation Research在线发表了河北医科大学温进坤教授为通讯作者的文章，介绍发现血管平滑肌细胞中调控α-actin基因表达的通路，其中circRNA circACTA2发挥重要作用[34]。

血管平滑肌细胞（VSMC）在调节血压等方面发挥重要作用，α-actin（α-SMA）是最重要的细胞骨架成分。已知TGF-β1可影响α-SMA表达，但关于α-SMA在分子细胞水平表达调控机制还没有研究清楚。本文作者发现EGF家族成员NRG-1的可溶剪切变体形式NRG-1-ICD可影响α-SMA的表达。进一步的研究表明NRG-1-ICD通过结合到α-SMA的第一内含子上面，募集转录因子IKZF1，促进α-SMA基因来源的circRNA circACTA2的形成，circACTA2通过竞争性结合miR-548f-5p抑制后者对α-SMA的表达抑制作用。在本文的研究结果中表明circACTA2的形成似乎与QKI和ADAR2都有关系，但作者没有对此展开太详细的探讨[34]。

图34 血管平滑肌细胞中circACTA2竞争性结合miR-548f-5p（来自[34]）

circHIPK3在糖尿病视网膜血管障碍中的作用

8月31日，著名循环学杂志Circulation在线发表了复旦大学眼耳鼻喉科医院颜标教授与赵晨教授为共同通讯作者的文章，介绍发现circHIPK3在糖尿病视网膜血管障碍中的作用[35]。

本文报道发现在糖尿病引起的视网膜血管功能障碍中circHIPK3（hsa_circ_0000284）显著升高，进一步的研究表明circHIPK3可以竞争性结合miR-30a-3p、miR-30d-3p和miR-30e-3p，它们可以通过调控VEGFC、 FZD4和WNT2基因，形成一种全新的调控回路，在糖尿病引起视网膜血管功能障碍中发挥作用[35]。

图35 circHIPK3及相关通路在视网膜血管功能障碍中的作用（来自[35]）

circRNA MFACR竞争性结合miR-652-3p抑制MTP18的翻译

5月12日，Nature子刊Cell Death & Differentiation杂志在线发表了青岛大学医学院李培峰教授和中国医学科学院北京阜外医院张宇辉为共同通讯作者的文章，介绍发现环形RNA MFACR通过竞争性结合miR-652-3p抑制MTP18的翻译，进而抑制线粒体分裂并影响细胞凋亡作用，最终在人类心脏疾病中发挥作用[36]。

本文首先发现了心肌梗死（MI）标本中MTP18过表达，又通过预测分析和实验验证，找到miR-652-3p通过结合MTP18的3’UTR序列并进一步证明了miR-652-3p与MI中线粒体分裂和细胞凋亡的关系。miRNA Sponge是环形RNA的重要功能模型，于是作者继续寻找能竞争性结合miR-652-3p的环形RNA，首先基于数据库检索，找出MI特异性变化的环形RNA，然后通过PCR验证，最终发现了MFACR。最后实验结果表明在心肌缺血再灌注模型中MFACR通过竞争性结合抑制了miR-652-3p，而miR-652-3p通过结合MTP18的mRNA并抑制其翻译过程，MTP18蛋白则促进线粒体分裂和细胞凋亡作用，在心肌梗死中发挥重要作用[36]。本文的思路与绝大多数环形RNA研究的思路不同，先是找到了疾病相关的蛋白，然后又找到了对应的调控miRNA分子，最后才预测和鉴定到环形RNA。

图36 MFACR竞争性结合miR-652-3p在心肌梗死中发挥作用（来自[36]）

敲低circRNA有助于提高血管内皮细胞功能

7月8日，Theranostics在线发表了复旦大学眼耳鼻喉医院Yan Biao和南京医科大学第四临床医医院Jiang Qin为共同通讯作者的文章，介绍发现敲低circZNF609可改善血管内皮功能障碍[37]。

血管功能障碍与癌症等多种疾病有关，本文作者发现敲低circRNA-ZNF609可改善血管内皮细胞的功能障碍。在体内模型中，敲低circRNA-ZNF609可降低视网膜血管减少并抑制病理性血管异常。体外实验也表明敲低circRNA-ZNF609可促进血管内皮细胞的功能。机制方面作者发现circRNA-ZNF609可竞争性结合miR-615-5p[37]。

图37 体内模型中干扰circRNA-ZNF609促进血管内皮细胞功能 （来自[37]）

QKI蛋白通过调控circRNAs抑制化疗药物阿霉素介导的心脏损伤

11月13日，Circulation Research杂志在线发表了德国汉诺威医学院Shashi Kumar Gupta和Thomas Thum为共同通讯作者的文章，介绍发现QKI5介导的circRNAs形成作用参与抑制化疗药物阿霉素介导的心脏损伤[38]。

化疗药物阿霉素处理小鼠心肌细胞的实验模型中，研究者用全转录组高通量测序发现，5个RNA结合蛋白在此过程中发生了差异表达，其中QKI显著下调，响应阿霉素的作用最强烈。敲低QKI蛋白可增加阿霉素处理心肌细胞的凋亡和萎缩，而外源过表达QKI可逆转阿霉素的作用，体内实验同样发现该现象。进一步研究表明QKI5可调控Ttn, Fhod3, and Strn3基因起源的circRNAs分子来实现抑制阿霉素的作用[38]。

图38 QKI5调控circRNA生成抑制阿霉素的作用 （来自[38]）

其他circRNA与心血管疾病相关的研究报道：

2.3 circRNA与其他人类疾病

除了肿瘤和心血管疾病，2017年还有许多人类疾病有circRNA的相关研究报道，由于体量巨大，我们只选择有代表性的几篇做简答介绍，后面会附上所有相关的文献的基本信息。

circ-ANXA2可作为多发性硬化症疾病标志物

6月23日，Human Molecular Genetics杂志在线发表了西班牙Biodonostia健康研究所Otaegui, David为通讯作者的文章，介绍在多发性硬化症（multiple sclerosis）中circRNA circ-ANXA2可作为疾病标志物的研究[39]。

多发性硬化症是一种自身免疫性疾病，本中作者基于芯片分析筛选了疾病相关的circRNAs，共找到了406种表达差异的circRNA。最终发现来源于ANXA2基因的circRNA可作为多发性硬化症的标志物[39]。