基因治疗包括DNA和RNA治疗，作为重组蛋白应用的有希望的替代方案而引起了极大的关注。DNA治疗使外源基因整合到细胞基因组中长期表达，但具有遗传变异的风险。而基于mRNA的蛋白质替代疗法具有转染效率高、无遗传变异风险、免疫原性低等诸多优点。然而，线性mRNA易降解，稳定性差，表达时间短，限制了其应用。环状RNA (circRNA)由于其共价闭合的环状结构而高度稳定，从而免受核酸外切酶介导的降解。虽然circRNA缺乏帽依赖翻译的基本要素，但可以设计成通过内部核糖体进入位点(IRES)进行蛋白质翻译，且不需要在开放阅读框(ORF)部分进行N6 -甲基腺苷(m6A)修饰。鉴于其固有的稳定性和可免除核苷酸修饰的特性，circRNA可能是替代传统蛋白质疗法更有价值的方案。

       近日，东南大学李新松教授团队联合东南大学附属中大医院整形外科专家郭宗科主任团队在Journal of Controlled Release上发表文章：A single dose of VEGF-A circular RNA sustains in situ long-term expression of protein to accelerate diabetic wound healing。文章阐述了该研究团队开发的一种LNP/VEGF-A circRNA纳米剂，通过原位长效表达和释放VEGF-A，加速糖尿病足溃疡模型小鼠的创面愈合，可能成为一种有前景的DFU治疗药物（已申请发明专利）。

一、 VEGF-A circRNA的合成与验证

        研究团队采用I型内含子自催化策略合成VEGF-A circRNA。同时制备1mΨ修饰或无修饰线性mRNA用作对比实验。VEGF-A circRNA的环状结构和纯度经过RNase R、RNase H、RT-PCR和Sanger测序验证，其表达能力也通过Western Blot检测转染VEGF-A circRNA的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的VEGF-A而得到验证。（图1）

二、 U-LNP/VEGF-A circRNA的包封与表征

        体内成像筛选的初步数据证实，U-105的LNP具有很强的转染能力。因此，研究采用可电离脂质为U-105（具有两个叔胺和两个羟基）的LNP包封配方，同时也采用了商业化的可电离脂质ALC-0315的LNP进行对比实验。动态光散射(DLS)、透射电子显微镜(TEM)、RiboGreen试剂和2-(对甲苯胺)-6-萘磺酸(TNS)分别表征U-LNP/VEGF-A circRNA。结果显示其平均直径为108.51 nm，多分散性指数（PDI）为0.21，Zeta电位为-3.31 mV；TEM观察U-LNP为球形结构，直径约为100 nm；包封效率约为87.12%；pKa值约为6.65。U-LNP/ VEGF-A circRNA的包封与其它配方无显著差异。（图2）

图2 U-LNP/VEGF-A circRNA的包封与表征。

三、U-LNP/VEGF-A circRNA的体外长效表达

        研究发现在4°C、25°C和37°C保存不同时间的VEGF-A circRNA都比线性VEGF-A mRNA更稳定。相比线性mRNA组，circRNA组的VEGF-A表达水平明显更高，且高表达持续时间更长。此外，U-105 LNP对RNA的保护和递送效率比ALC-0315 LNP更佳。结果表明，U-LNP/VEGFA circRNA可以被传递到细胞中，并持续高水平表达蛋白质，性能更好。（图3）

图3 U-LNP/VEGF-A circRNA的体外长效表达。

四、 U-LNP/VEGF-A circRNA的溶酶体逃逸及体外生物相容性

        有效递送RNA的LNP载体必须从溶菌酶逃逸。此外，细胞毒性也是评价LNP载体的重要标准。溶酶体逃逸和CCK8实验验证了U-LNP/circRNA能成功逃逸溶酶体，且没有细胞毒性。U-LNP/VEGF-A circRNA处理的HUVECs细胞增殖率明显高于裸circRNA组，这可能与溶酶体逃逸以及VEGF-A的表达有关。（图4a-e）

        通常RNA制剂的先天免疫反应是由未修饰的mRNA上调相关细胞因子引发的，而1mΨ修饰mRNA可改善这情况。为对比circRNA制剂与线性mRNA的免疫原性，采用qPCR法检测各种制剂处理的HUVECs上清液中相关细胞因子的表达，发现circRNA组和1mΨ修饰mRNA组的免疫反应率都远低于未修饰的线性mRNA组；U-LNP/VEGF-A circRNA诱导的先天免疫反应略弱于A-LNP/VEGF-A circRNA。这证实circRNA与1mΨ修饰mRNA具有相似的生物相容性，U-105 LNP表现优于ALC-0315 LNP。（图4f）

五、体外验证U-LNP/VEGF-A circRNA对细胞增殖、迁移和血管形成的影响

        细胞增殖和迁移是血管生成和纤维生成的基础，是决定创面愈合的重要因素。通过体外实验验证了U-LNP/VEGF-A circRNA可以连续且显著地翻译成激活内皮细胞增殖、迁移和血管形成的VEGF-A，促进细胞增殖、迁移和血管形成，且效果优于线性mRNA，U-105 LNP效果略优于ALC-0315 LNP。因此，VEGF-A circRNA可能在DFU创面愈合中发挥重要作用。（图5）

图5 体外验证U-LNP/VEGF-A circRNA对细胞增殖、迁移和血管形成的影响。

六、U-LNP/circRNA对创面愈合的原位长效作用

        U-LNP/circRNA对C57BL/6糖尿病模型创面治疗效果显著优于A-LNP组、线性mRNA组或裸circRNA组。研究还设置了rhVEGF蛋白组作为对比。结果显示，rhVEGF可以促进正常小鼠的创面愈合，但对糖尿病小鼠的愈合没有明显促进作用，可能由于其在糖尿病创面微环境下快速降解，导致作用持续时间太短。与rhVEGF组相比，U-LNP/VEGF-A circRNA对糖尿病小鼠创面愈合的影响显著改善。

        治疗期间各组血糖无明显差异，治疗后的糖尿病小鼠的心、肝、脾、肺、肾均无明显损伤，且创面周围皮肤炎症相关因子水平无显著差异，证明U-LNP/VEGF-A circRNA在体内无明显毒性，且免疫原性较低。综上所述，U-LNP/VEGF-A circRNA因其显著修复效果、持续表达生长因子和低毒性而表现出独特的优势。（图六）

图6 U-LNP/circRNA对创面愈合的原位长效作用。

七、创面愈合的组织学分析

        组织学分析表明，U-LNP/VEGF-A circRNA处理组显著增加了糖尿病模型创面周围组织的肉芽组织的厚度，且真皮成熟胶原百分比和血管密度优于VEGF-A mRNA组。U-LNP/VEGF-A circRNA处理的糖尿病小鼠创面部位B细胞、T细胞和巨噬细胞数量无显著差异。总之，U-LNP/VEGF-A circRNA通过促进肉芽组织生成、增强胶原沉积和刺激血管生成促进糖尿病小鼠创面愈合，且免疫原性低。因此，U-LNP/VEGF- A circRNA制剂可能成为一种安全、高效的替代VEGF蛋白促进糖尿病创面愈合的DFU新药。（图七）

图7 创面愈合的组织学分析。

总结

        研究采用可电离脂质U-105 LNP包封VEGF-A circRNA，成功开发了可加速DFU创面愈合的U-LNP/VEGF-A circRNA纳米剂。U-LNP/VEGF-A circRNA与线性mRNA相比稳定性更好，且可在体外和体内持久表达活性蛋白。U-LNP/VEGF-A circRNA无细胞毒性，免疫原性低。单剂U-LNP/VEGF-A circRNA处理后第12天就能使糖尿病小鼠创面几乎完全愈合，效果显著优于线性VEGF-A mRNA、rhVEGF和A-LNP/circRNA。ULNP/VEGF-A circRNA对糖尿病创面愈合的促进作用可归因于circRNA的VEGF-A的持续表达。因此，U-LNP/VEGF-A circRNA纳米剂可能是一种有临床前景的DFU创面治疗策略。

circCDK13是一种有前景的糖尿病伤口治疗药物

研究团队通过生信分析，以及利用AGE-BSA处理人真皮成纤维细胞(HDFs)和人表皮角质形成细胞(HEKs)模拟糖尿病伤口体外微环境的实验，发现circCDK13在糖尿病足溃疡(DFU)中表达下调。（图1a-e）

circCDK13在HDFs和HEKs中的表征

研究通过收敛和发散引物进行PCR，结合Sanger测序/放线菌素D/RNase R耐受实验验证了circCDK13的环状结构（图1f-l），并通过FISH和核质分离实验证明circCDK13定位于细胞质中。（图1m-n）

图1. circCDK13在糖尿病创面中表达下调。

circCDK13在体外促进HDFs和HEKs的增殖和迁移

研究团队利用siRNA和过表达载体敲低/过表达HDFs和HEKs中circCDK13，通过CCK-8/EdU染色/划痕/Transwell实验，结果表明circCDK13使HDFs和HEKs活力和增殖水平显著提高，迁移能力明显增强。（图2）

图2 circCDK13在体外促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。

circCDK13以依赖m6A的方式与IGF2BP3相互作用

研究通过RNA pull-down和LC-MS/MS分析，联合catRAPID omics v2.0预测IGF2BP3可能为与circCDK13互作的候选RBP；利用RNAfold预测circCDK13的二级结构，并用NPDock预测circCKD13和IGF2BP3的物理互作；通过RNApull-down/RIP-qPCR/FISH-IF进一步在HDFs和HEKs中证实了circCDK13和IGF2BP3相互作用。（图3a-j）

作者通过对circCDK13上IGF2BP3预测结合区进行突变，验证了IGF2BP3的KH结构域和circCDK13“ACAAACA”序列对两者互作的重要性。由于IGF2BP3是一种m6 A结合蛋白，通过MeRIP实验，研究团队发现METTL3和METTL14的缺失会破坏circCDK13和IGF2BP3的互作，并验证了circCDK13的m6A修饰维持circCDK13和IGF2BP3的相互作用。（图3k-o）

circCDK13和IGF2BP3之间的相互作用增强了彼此的稳定性

研究通过对敲低或过表达IGF2BP3进行qRT-PCR/Western Blot/放线菌素D实验，以及敲低或过表达circCDK13并利用环己亚胺抑制新蛋白合成实验，证明了circCDK13和IGF2BP3之间的相互作用增强了彼此的稳定性。（图3p-t）

图3 circCDK13以依赖m6A的方式与IGF2BP3相互作用。

circCDK13与IGF2BP3协同促进HDFs和HEKs的增殖和迁移

挽救实验证明，IGF2BP3和circCDK13协同促进HDFs和HEKs增殖和迁移。IGF2BP3或circCDK13敲低显著降低了c-MYC、CD44和CyclinD1蛋白的表达水平，而IGF2BP3或circCDK13过表达则有相反的结果。进一步的挽救实验也证明了circCDK13和IGF2BP3对c-MYC和CD44 mRNA的影响可能是相互依存的。（图4a-h）

研究通过circCDK13探针和IGF2BP3抗体pull-down实验，证明了circCDK13和IGF2BP3与c-MYC和CD44 mRNA相互作用。免疫荧光结果显示，与对照组相比，DFU组的HDFs和HEKs中IGF2BP3、c-MYC和CD44蛋白的表达水平显著降低（图3i）。结合文献报道，作者推测在HDFs和HEKs中，circCDK13和IGF2BP3通过增强c-MYC和CD44 mRNA的稳定性，增加c-MYC和CD44蛋白的表达，从而促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。

图4 circCDK13与IGF2BP3协同促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。

负载circCDK13的工程化sEVs的制备和特征

为了促进circCDK13在伤口愈合和组织再生中的潜在应用，研究团队构建了含有高丰度circCDK13的工程sEV。通过circCDK13慢病毒载体感染人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞(CPMSCs)（图5a），然后超速离心得到sEVs。团队通过TEM/NTA/WB验证sEV的特征（图5b-d），qPCR鉴定sEV中的circCDK13（图5e），利用RNase A/T1混合物或Triton X100的处理验证circCDK13oe – sEVs的负载效果（图5f）。

circCDK13oe – sEVs在体外促进HDFs和HEKs的增殖和迁移

研究团队使用CM-DiI标记sEVs，验证sEV在HDFs和HEKs中的成功内化（图5g）。circCDK13oe – sEVs与HDFs和HEKs共孵育，结果表明circCDK13oe – sEVs共孵育细胞中circCDK13丰度增加（图5h），circCDK13oe – sEVs可以促进HDFs和HEKs的增殖和迁移能力，消除AGE-BSA和高浓度D-葡萄糖(HG)对增殖和迁移的抑制作用（图5i-n），并显著上调IGF2BP3、c-MYC、CD44和Cyclin D1的蛋白表达水平（图5o）。

图5 circCDK13oe – sEVs促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。

circCDK13oe – sEVs在体内加速伤口愈合

研究团队建立db/db糖尿病小鼠模型，或腹腔注射STZ建立I型糖尿病大鼠模型，并在背部创造两个全层皮肤伤口，然后皮下注射circCDK13oe – sEVs、N- sEV或等体积的PBS。相比对照组，circCDK13oe – sEVs处理的伤口愈合速度明显较快。研究团队通过H&E染色/Masson’s染色/WB/IF检测，结果表明，与N- sEV相比，circCDK13oe – sEVs在促进糖尿病创面愈合方面表现更好，主要表现为促进创面再上皮化、肉芽组织形成、胶原沉积以及毛囊和皮脂腺的再生。机制上，circCDK13oe – sEVs可能通过形成
circCDK13-IGF2BP3-CD44/c-MYC三元复合物促进CD44和c-MYC的表达，从而促进糖尿病创面愈合。（图6-7）

图6 circCDK13oe – sEVs加速db/db糖尿病小鼠的伤口愈合。

图7 circCDK13oe – sEVs促进STZ诱导的I型糖尿病大鼠的伤口愈合。

总结

综上所述，团队研究了糖尿病伤口延迟愈合的潜在机制。circCDK13通过m6A修饰依赖的方式与IGF2BP3相互作用，形成circCDK13- IGF2BP3-mRNA复合物，稳定CD44和c-MYC mRNA，并上调CD44和c-MYC的表达，促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。此外，团队成功构建了含高丰度circCDK13的工程化sEV，并证实circCDK13oe – sEVs能促进糖尿病小鼠模型的伤口愈合。该研究表明，sev中递送circCDK13可能成为糖尿病创面治疗的新策略，circCDK13oe – sEVs作为一种有前景的糖尿病创面愈合的治疗策略，具有很大的临床应用潜力。

环状RNA (circRNAs)是共价封闭的环状RNA分子，比线性mRNA更稳定。因此，利用 circRNA在功能性免疫细胞的细胞膜上表达CAR可能比mRNA表达量更高、表达更持久，从而产生更有效的抗肿瘤免疫。

近日，复旦大学璩良、徐一驰和邱敏研究员联合中国科学院北京纳米能源与系统研究所罗聃研究员在BioRxiv预印本上传研究论文：Synergically enhanced anti-tumor immunity of in vivo CAR by circRNA vaccine boosting，描述了利用免疫细胞趋向性的LNP体内递送编码CAR蛋白的circRNACAR，显著抑制肿瘤生长，并诱导促炎症小鼠肿瘤微环境；共同使用circRNAAnti-HER2-CAR与编码HER2抗原的癌症疫苗circRNAHER，可协同增强的抗肿瘤活性。该研究表明，基于circRNA体内表达CAR与肿瘤抗原(称为体内CAR- VAC)的结合，有可能成为一种升级的成品免疫疗法。

CircRNACAR可在T细胞和巨噬细胞中有效表达CAR蛋白

研究团队对HER2 CAR序列进行密码子优化后，采用I型内含子自剪接策略合成表达HER2 CAR蛋白的circRNA（circRNACAR），采用HPLC和RNase R处理得到高纯度circRNACAR，将circRNACAR转染到细胞中，通过Western Blot验证CAR蛋白的表达，选出表达最高效的circRNACAR-opt-3进行下一步研究。（图1a-g）

CircRNACAR有效介导T细胞和巨噬细胞的肿瘤杀伤作用

研究团队将转染了CircRNAAnti-HER2-CAR的Jurkat细胞（永生人类T细胞）、THP-1（永生化人类巨噬细胞）或J774A.1（永生化小鼠巨噬细胞）分别与不同的靶向肿瘤细胞共培养。结果显示，转染CircRNAAnti-HER2-CAR的三种细胞均能以剂量效应显著杀伤表达HER2的肿瘤细胞。此外，研究团队还验证了编码anti-CD19 CAR蛋白的circRNA，也可以杀伤异位表达CD19抗原的A549肺癌细胞。综上，circRNACAR可在体外介导T细胞和巨噬细胞的肿瘤杀伤活性。（图1h-q）

图1 CircRNACAR在T细胞和巨噬细胞中有效表达CAR蛋白，并介导显著的肿瘤杀伤作用。

circRNACAR可诱导巨噬细胞的高效肿瘤吞噬作用和促炎极化

研究团队将转染circRNACAR的THP-1或J774A.1细胞，然后分别与多种靶向肿瘤细胞共培养。结果显示，circRNACAR能显著诱导THP-1或J774A.1细胞对不同癌症细胞的吞噬能力，且转染circRNACAR的THP-1和J774A.1都表现为促炎极化。（图2a-k）

研究团队进一步通过RNA-seq分析，结果发现转染circRNACAR的THP-1细胞中存在一系列促炎功能、吞噬能力、代谢和其他免疫反应相关的基因表达上调，表明circRNACAR具有诱导巨噬细胞M1极化的潜力。（图2l-n）

图2 巨噬细胞表现出circRNACAR诱导的有效肿瘤吞噬作用和促炎极化。

筛选将环状RNA有效递送到小鼠免疫细胞中的脂质纳米粒

脾脏主要由T细胞、B细胞和巨噬细胞等免疫细胞组成，是LNPs靶向递送circRNACAR的重要免疫器官。此外，肿瘤微环境中含有大量的肿瘤相关巨噬细胞、T细胞和树突状细胞。研究团队通过改造阳离子脂质的头部和尾部集团，最终筛选出靶向脾脏的LNP。研究团队将LNP-circRNALuciferase静脉注射到BALB/c小鼠体内，验证了该LNP靶向脾脏；注射到皮下成瘤小鼠的肿瘤中，验证了该LNP集中分布在肿瘤区域。综上，LNP-circRNA能在体内高效递送到免疫细胞中。此外，研究团队还验证了前人研究的选择性ORgan靶向（SORT）方法，也能分别靶向脾脏和肿瘤区域。（图3a-h）

图3 筛选能有效将circRNAs递送到小鼠免疫细胞中的脂质纳米粒。

CircRNACAR有效抑制小鼠肿瘤生长并延长存活时间

该研究发现，静脉注射SORT-LNP circRNACAR到CT26-HER2结直肠癌BALB/c小鼠中，能显著抑制肿瘤生长。LNP-circRNACAR瘤内给药能显著抑制BALB/c小鼠皮下CT26-HER2结肠癌肿瘤、4T1乳腺癌肿瘤、MC38-HER2结肠癌肿瘤生长，甚至可实现皮下瘤的完全消退，延长荷瘤小鼠的存活时间。总之，circRNA体内表达CAR在治疗实体瘤方面具有很好的疗效。（图4a-l）

图4 circRNACAR有效抑制小鼠的肿瘤生长并延长存活时间。

CircRNACAR将小鼠的肿瘤微环境调整为促炎状态

实体瘤通常难治，部分原因是抑制免疫的肿瘤微环境。CircRNACAR是否会影响小鼠的肿瘤微环境呢？研究团队利用流式细胞术/IHC检测小鼠脾脏和肿瘤组织中的免疫细胞，发现circRNACAR治疗的小鼠模型脾脏和肿瘤组织中CD8+T、 CD4+T等促炎相关细胞比例增加，但Treg细胞的比例降低。H&E染色结果显示，circRNACAR治疗组的肿瘤细胞死亡显著增加。（图5a-d）

研究团队进一步对免疫细胞进行了RNA-seq分析，结果显示circRNACAR组有一系列的促炎相关基因上调，表明肿瘤微环境中存在免疫细胞浸润；多个与B细胞免疫相关的通路显著上调，表明抗体可能在体内CAR治疗的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。由这些结果可见，在荷瘤小鼠模型中，circRNACAR可以显著地将肿瘤微环境重塑为促炎状态，这有助于增敏免疫治疗。（图5e-f）

图5 CircRNACAR将小鼠肿瘤微环境重塑为促炎状态。

CircRNA疫苗通过抗体介导的细胞毒性协同增强体内CAR治疗的抗肿瘤活性

RNA-seq结果发现circRNACAR的抗肿瘤作用可能与B细胞反应有关。抗体依赖的细胞毒性（ADCC）或者细胞吞噬作用（ADCP）可以促进巨噬细胞或NK细胞的吞噬或杀伤作用。此外，CAR疫苗已被证实可提升CAR-T细胞抗肿瘤效应。因此，团队进一步研究circRNA疫苗能否以ADCC或ADCP效应，协同增强基于circRNA体内表达CAR的抗肿瘤免疫治疗。

研究团队开发了一种高效表达和分泌HER2融合蛋白抗原的circRNA疫苗（circRNAVAC）。体内验证结果表明， CT26-275 HER2结直肠癌C57BL/6小鼠中，与PBS、单独circRNACAR或单独circRNAVAC治疗相比，静脉注射或瘤内注射circRNACAR和circRNAHER2疫苗的组合表现出更好的肿瘤抑制效果和存活率（图6a-i）

图6 CircRNA疫苗协同增强体内CAR疗法的抗肿瘤活性。

总结

该研究基于circRNA结合体内CAR和癌症疫苗建立了一种新的联合免疫疗法，在小鼠模型中验证了瘤内或静脉注射circRNA疫苗可协同提高基于circRNA的体内CAR的抗肿瘤免疫作用。

目前主流研究的CAR-T细胞疗法（嵌合抗原受体T细胞免疫）需要分离患者体内T细胞，通过基因工程技术使T细胞表达能识别肿瘤细胞并激活T细胞的嵌合抗原受体（即CAR），再将经过扩增的CAR-T细胞回输到患者体内，识别并攻击表达相关抗原的肿瘤细胞，是过继治疗（ACT）的方法之一。

与过继性体外CAR-T细胞疗法不同，该研究利用基于circRNA技术的体内CAR-T疗法，将编码特定CAR的circRNA递送到体内免疫细胞中，使体内免疫细胞表达CAR，识别并攻击表达相关抗原的肿瘤细胞。体内CAR-T疗法无需分离患者体内T细胞进行编辑、扩增、再回输，相比CAR-T细胞疗法，具有成本低、便捷、现货、无需骨髓清除、可重复使用且无基因组整合风险等优点。基于circRNA的CAR-T免疫疗法为未来治疗实体瘤提供了一种升级的新治疗策略。

璩良丨复旦大学基础医学院 研究员

璩良, 复旦大学基础医学院研究员，组建RNA疫苗技术与免疫治疗实验室，致力于新型RNA疫苗及治疗技术开发与免疫治疗研究。2022年曾在Cell杂志上首次报道circRNA疫苗技术平台、拓展了RNA治疗技术新领域。璩良教授确认出席第八届circRNA研究与产业论坛，并发表主题演讲，敬请期待！

2024年5月22日，中山大学附属第三医院肝外科和肝移植中心郑俊以及中国南方医科大学广东省人民医院胃肠外科李勇、郑佳彬、潘子豪团队在Drug Resistance Updates（IF=15.8）发表文章CircPDIA3/miR-449a/XBP1 feedback loop curbs pyroptosis by inhibiting palmitoylation of the GSDME-C domain to induce chemoresistance of colorectal cancer。本研究表明circPDIA3直接与GSDME-C结构域结合，通过阻断ZDHHC3和ZDHHC17的GSDME-C结构域棕榈酰化，增强GSDME-C结构域的自抑制作用，从而抑制细胞焦亡。这些发现为了解circRNA如何通过RNA结合蛋白（RBP）调控细胞焦亡的方式诱导化疗耐药提供了信息，同时也为预防和治疗CRC化疗耐药提供了新的靶点和方向。

circPDIA3在CRC中的鉴定

作者首先对OXA治疗敏感/耐受的CRC患者组织进行RNA测序分析，并结合circRNA在线数据库筛选出hsa_circ_0002891（称为circPDIA3）（图1B-C）。

作者通过Sanger测序鉴定了circPDIA3的特异性剪接位点（图1D）。此外，作者研究了circPDIA3在结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中的表达。数据显示，circPDIA3在CRC细胞系中的表达显著高于NCM460细胞（图1E）。作者通过背靠背引物验证，结合RNase R和放线菌素D处理实验，表明circPDIA3的环状结构相对更稳定（图1F-H）。核RNA和细胞质RNA分析和FISH实验发现cirPDIA3主要定位于细胞质（图1I-J）。

图1 circPDIA3在CRC中的鉴定

CircPDIA3促进了体外化疗的耐药性

作者构建了circPDIA3 敲低载体和过表达载体。结果发现，敲低或过表达circPDIA3对PDIA3的线性表达没有影响（图2A）。CCK-8试验表明，敲低circPDIA3可使OXA耐药细胞对OXA敏感，而过表达 circPDIA3 则相反（图 2B）。同样，克隆形成和EdU检测也表明，circPDIA3的下调增加了OXA耐药细胞对OXA的敏感性，circPDIA3的上调则相反（图2C-D）。此外，凋亡检测证实，在circPDIA3敲低的OXA耐药细胞中，经OXA处理的Annexin V+、PI+单染的细胞的总百分比显著增加，而过表达circPDIA3相反（图2E）。综上所述，体外实验表明，circPDIA3与CRC细胞中的OXA耐药性有关。

图2 CircPDIA3降低了体外结直肠癌对OXA的化学敏感性

CircPDIA3促进了PDX模型和CRC患者的化疗耐药性

作者利用CRC患者组织建立了异种移植（PDX）模型（图3A）。并通过在肿瘤内注射circPDIA3 ASO，观察到ASO-circPDIA3组对OXA的敏感性高于ASO-NC组（图3B-D）。IHC染色证实，Ki- 67的表达随着circPDIA3的减少而降低（图3E-F）。qRT-PCR检测表明ASO-circPDIA3显著抑制了circPDIA3的表达（图3G）。临床研究表明，有复发或转移的CRC患者中circPDIA3的表达高于无复发或转移的患者（图3H）。Kaplan-Meier曲线证实，circPDIA3高表达的患者的DFS率明显低于circPDIA3低表达的患者（图3I）。综上所述，circPDIA3可以作为CRC患者OXA反应的独立预测因子。

图3 CircPDIA3在PDX模型中促进了对OXA的耐药性，并与CRC患者的OXA治疗反应相关

CircPDIA3与GSDME以直接结合的方式相互作用

作者进一步研究与circPDIA3相互作用的蛋白质。RNA pulldown和质谱实验结果显示，GSDME是焦亡途径的关键效应因子，且丰度最高（图4A）。此外，circPDIA3可以与内源性或重组GSDME相互作用，表明circPDIA3与GSDME直接结合（图4B-C）。在GSDME RIP实验中，circPDIA3的显著富集（图4D）。此外，circPDIA3 和GSDME 在CRC细胞中显示细胞质共定位（图4E）。

此外，利用RNA-蛋白相互作用预测（RPISeq）鉴定circPDIA3相互作用蛋白，发现circPDIA3可能直接与GSDME相互作用。然后，使用catRAPID平台，分析circPDIA3核苷酸与GSDME残基之间的精确相互作用（图4F-G）。为了验证GSDME上的circPDIA3结合区域，作者构建了带有Flag标记的全长GSDME及其缺失的突变体（图4H）。RNA pulldown和RIP分析证实，GSDME的C结构域区域，是其与circPDIA3相互作用的关键（图4I-J）。此外，作者还使用HADDOCK2.4上的计算机算法分析了circPDIA3和GSDME的相互作用（图4K）。综上所述，circPDIA3在CRC细胞中与GSDME发生相互作用。

图4 CRC细胞中circPDIA3与GSDME蛋白直接相互作用的鉴定

CircPDIA3增强了GSDME-C结构域的自抑制作用

作者进一步发现circPDIA3敲除的OXA抗性细胞在OXA反应时表现出更明显的细胞肿胀和球囊样肿胀的微观特征，这是焦亡细胞的形态学特征（图5A）。细胞LDH释放实验，结果显示circPDIA3的下调显著增加了OXA耐药细胞向细胞上清中LDH的释放。（图5B）。在OXA耐药细胞中，circPDIA3的敲低减少了激活的caspase-3对GSDME的裂解，而过表达则相反（图5C）。

作者推测circPDIA3可能通过与GSDME-C结构域相互作用，参与调控GSDME的自抑制，从而抑制GSDME的焦亡。Co-IP试验表明，circPDIA3显著增强了GSDME-C-残基结构域的相互作用，且呈剂量依赖性（图5D-E）。同时，circPDIA3的过表达抑制了293 T细胞中的焦亡（图5F-G）。此外，circPDIA3过表达促进了GSDME-C结构域与GSDME-N结构域结合，从而抵消了GSDME-N结构域触发焦亡的活性（图5H-I）。作者进一步将GSDME-C结构域的氨基酸进行细分，进行缺失突变。这些缺失突变表明293 T细胞在circPDIA3存在的情况下发生焦亡（图5J-K）。且减弱了GSDME-N结构域和GSDME-C结构域之间的相互作用（图5L）。综上所述，circPDIA3通过与GSDME-C结合，增加了GSDME-C与GSDME-N的相互作用，从而上调了GSDME的自抑制，而不是持续诱导焦亡。

图5 CircPDIA3促进活化的caspase-3与GSDME的相互作用，诱导焦亡

CircPDIA3抑制的GSDME-C棕榈酰化放大了GSDME-C结构域的自抑制作用

为了检测circPDIA3是否参与了GSDME-C结构域棕榈酰化的调控，作者用脱脂酰化酶抑制剂棕榈酰抑制素B（PalmB）处理293 T细胞。PalmB消除了circPDIA3对GSDME-C结构域棕榈酰化的抑制。相比之下，棕榈酰化抑制剂2-溴磷磷酸酯（2-BP）的处理进一步减弱了GSDME-C结构域的棕榈酰化（图6A）。在circPDIA3存在下，GSDME-C结构域与GSDME-N结构域的相互作用被PalmB阻断，而被2-BP进一步增强，表明circPDIA3负调控GSDME-C结构域棕榈酰化（图6B）。接着作者进一步鉴定了参与调控GSDME-C结构域棕榈酰化的特异性ZDHHC棕榈酰基转移酶，结果发现，ZDHHC3和ZDHHC17可能通过激活293 T细胞中的GSDME-C结构域棕榈酰化来抑制GSDME-C结构域的自抑制（图6C-E）。同样，过表达circPDIA3可以消除ZDHHC3或ZDHHC17对GSDME-C结构域棕榈酰化的促进作用，并提高GSDME-C结构域的自抑制作用（图6D-E）。

棕榈酰化主要发生在4个C残基上，只有当所有四个候选C残基都发生突变（GSDME-C 4CA）时，GSDME-C结构域的棕榈酰化才被消除。当ZDHHC3或ZDHHC17过表达时，GSDME-C结构域的棕榈酰化增强，其自抑制作用减弱，而GSDME-C 4CA没有明显变化（图6F-G）。与预期一致的是，当这四个C残基突变为A残基时，circPDIA3由于无法抑制GSDME-C结构域的棕榈酰化而失去了增强其自抑制作用的能力（图6H-I）。综上所述，circPDIA3通过抑制GSDME-HHC3-和ZDHHC17依赖的GSDME-C结构域的棕榈酰化，增强了GSDME-C结构域的自抑制作用。

图6 circPDIA3对GSDME诱导焦亡活性的自抑制调控

CircPDIA3在体内外发挥OXA耐药促进作用，依赖于与GSDME的结合

基于circPDIA3与GSDME-C结构域的特异性结合区域，进一步探讨circPDIA3是否通过与GSDME-C结构域结合抑制GSDME-C棕榈酰化来促进OXA抗性，作者构建并验证了circPDIA3 突变质粒（circPDIA3-MUT）（图7A-B）。同时，RIP实验证实，circPDIA3-MUT质粒不能与GSDME结合（图7C）。CCK-8检测、集落形成、EdU检测和凋亡检测证实，阻断circPDIA3与GSDME的结合会增加体外CRC细胞对OXA的敏感性（图7D-G）。与野生型circPDIA3相比，转染circPDIA3-MUT的OXA敏感细胞对OXA表现出更明显的细胞肿胀和球囊状肿胀的微观特征，而细胞LDH释放试验显示circPDIA3-MUT显著增加了OXA敏感细胞上清中LDH的释放（图7H-I）。Western blot实验证实突变体circPDIA3恢复了裂解的GSDME-N结构域（图7J）。此外，共免疫共沉淀分析表明，突变体circPDIA3丧失了增强GSDME-C结构域与GSDME-N结构域相互作用的能力（图7K-L）。与预期一致，突变体circPDIA3不能抑制GSDME-C结构域棕榈酰化（图7M）。因此，circPDIA3依赖于与GSDME的结合来促进OXA的抗性。

接下来，作者在小鼠模型中研究了突变体circPDIA3在调节OXA抗性中的作用。结果表明，circPDIA3-MUT组的肿瘤体积和重量明显大于circPDIA3组（图7N-P）。IHC分析显示，circPDIA3-MUT组的Ki-67水平降低（图7Q-R）。血清LDH分析显示，与circPDIA3组相比，circPDIA3-MUT组的LDH释放量减少，这与体外实验结果一致（图7S）。此外，免疫印迹分析显示，circPDIA3-MUT组的GSDME-N增加，证明重新激活焦亡（图7T）。综上所述，circPDIA3 使小鼠细胞对 OXA 处理敏感，并依赖于GSDME的结合。

图7 CircPDIA3依赖于与GSDME的结合来诱导OXA抗性

circPDIA3在CRC中的表达受XBP1调控

由于PDIA3转录驱动circPDIA3的表达，作者推测参与调控PDIA3转录的转录因子可能对circPDIA3发挥类似的作用。作者使用了PROMO数据库和GEPIA数据库预测出XBP1与PDIA3的正相关性最强（图8A-B）。qRT-PCR分析显示，过表达XBP1上调了circPDIA3的表达，而下调XBP1则相反（图8C）。通过分析JASPAR数据库，在PDIA3启动子区域（R1和R2）上发现了两个XBP1结合基序，并据此为这些区域设计了两个引物（P1和P2）（图8D-E）。ChIP-PCR分析结果显示XBP1主要与P1区域的PDIA3启动子结合（图8F-G）。此外，构建野生型（WT）和突变型（MUT）PDIA3序列，荧光素酶报告基因分析显示，XBP1过表达显著增加了WT的荧光素酶活性，而XBP1敲低得到相反的结果（图8H-I）。综上所述，XBP1通过与PDIA3启动子结合，促进circPDIA3的表达。

图8 XBP1促进了circPDIA3的表达

CircPDIA3通过海绵化miR-449a形成一个上调XBP1的正反馈回路

研究表明，过表达circPDIA3增加了CRC细胞中XBP1的表达水平（图9A）。随后，作者使用了starBase 、miRDB、circMine和TargetScan预测出miR-34a-5p和miR-449a与circPDIA3和XBP1相互作用（图9B）。RNA pulldown结果发现miR-449a被CRC细胞中生物素标记的circPDIA3探针显著捕获（图9C）。双荧光素酶结果显示，circPDIA3可以与miR-449a相互作用（图9D-E）。此外，RIP实验进一步说明了circPDIA3与miR-449a结合的特异性（图9F），表明circPDIA3可能海绵吸附miR-449a。接下来，作者分析验证了miR-449a与XBP1的3‘非翻译区（3’UTR）之间的关系。结果表明miR-449a可以通过靶向3‘UTR区调控XBP1的表达（图9G-J）。

为了探索circPDIA3、miR- 449a和XBP1之间的相互作用关系，荧光素酶报告基因分析显示，circPDIA3过表达显著增加了WT XBP1 3‘UTR的荧光素酶活性，而共转染miR- 449a模拟物则抵消了这种效应（图9K）。qRT-PCR和Western blot检测，结果证实circPDIA3过表达显著上调了XBP1的mRNA和蛋白水平，而共转染miR-449a模拟物消除了这种效应，反之亦然（图9I-J）。QRT-PCR结果显示，XBP1在CRC组织中的表达水平与circPDIA3水平呈正相关，与miR-449a水平呈负相关。综上所述，circPDIA3可以作为ceRNA海绵化miR-449a，调控XBP1的表达，形成一个正反馈回路。

图9 CircPDIA3通过靶向miR-449a调控XBP1的表达

circPDIA3的抑制增加了体内对OXA的敏感性

为了进一步研究ASO-circPDIA3联合OXA对体内肿瘤生长的影响，作者建立了一个基于过表达circPDIA3的HCT116细胞的异种移植小鼠模型。结果表明，与单独缺乏circPDIA3相比，抑制circPDIA3联合OXA治疗后，肿瘤体积和重量减少，表明抑制circPDIA3显著使小鼠细胞对OXA治疗敏感（图10A-D）。IHC分析显示，在ASO-circPDIA3 + OXA组中发现Ki-67水平下降（图10E-F）。此外，qRT-PCR实验验证了ASO-circPDIA3在肿瘤组织中的有效抑制作用（图10G）。血清LDH分析显示，与其他各组相比，ASO-circPDIA3 + OXA组的LDH释放量减少，与体外实验结果一致（图10H）。此外，Western blot分析显示，ASO-circPDIA3 + OXA组表现出GSDME-N水平的升高，这为circPDIA3表达降低激活体内焦亡提供了证据（图10I）。综上所述，抑制circPDIA3可以显著提高CRC细胞对OXA的敏感性。

图10 CircPDIA3有助于CRC细胞体内OXA耐药

总结

总之，circPDIA3在结直肠癌中高表达，并与结直肠癌患者的OXA耐药和DFS较差呈正相关。本研究鉴定了GSDME-C结构域作为circPDIA3的靶点，并证明了circPDIA3可以抑制焦亡。在机制上，由于circPDIA3抑制了GSDME-C结构域的棕榈酰化，从而放大了GSDME-C结构域的自抑制作用，从而增强了GSDME-C结构域对GSDME-N结构域的抑制作用。此外，本研究还验证了一个circPDIA3/ miR-449a/XBP1正反馈回路的存在，可诱导化疗耐药性。综上所述，本研究探索了circPDIA3在结直肠癌中的化疗耐药作用，结果提示circPDIA3可以作为克服结直肠癌患者OXA耐药的潜在生物标志物和治疗靶点。

磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）在包括乳腺癌、肺癌和肝细胞癌在内的多种人类癌症中经常上调[5]。过表达PGAM1促进癌症进展，而使用shRNA或抑制剂抑制PGAM1的表达可以有效抑制癌症进展。然而，癌细胞中PGAM1失调表达的分子机制目前仍不清楚，其次目前尚不清楚circRNA是否参与肿瘤微环境中能量应激条件下癌细胞的代谢改变。更具体地说，还没有能量代谢应答circRNA是否可以将糖酵解与肿瘤发生结合起来。

2024年5月21日，中国科学技术大学梅一德教授及安徽医科大学王芳教授团队在Cell Death & Disease发表文章Energy stress-induced circDDX21 promotes glycolysis and facilitates hepatocellular carcinogenesis。结果显示，作者发现了circDDX21在缺糖损伤中被转录因子c-Myc上调，在功能上，circDDX21通过增加PGAM1的表达来促进糖酵解。在机制上，circDDX21通过抑制MKRN3介导的PABPC1泛素化，增加PABPC1与PGAM1 mRNA的结合，从而增强PGAM1的mRNA稳定性。此外，circDDX21作为致癌的circRNA促进肝细胞癌的进展，证实了circDDX21是糖酵解的重要调节因子，并表明circDDX21可能是治疗肝细胞癌的潜在靶点。

circDDX21在缺糖损伤中被诱导及参与糖酵解途径

1. 作者通过RNA-seq分析，从缺糖损伤中的HEPG2细胞筛选得到了28个差异表达的circRNA，其中15个显著上调，并进一步筛选得到5个circRNA：circDDX21、circNEDD4L、circASPH、circCHD6和circEPB41。

2. 通过糖酵解速率测定了细胞外酸化率，发现敲低circDDX21后，HEPG2细胞的糖酵解速率急剧下降，暗示了circDDX21对糖酵解的特异性调节作用。在缺糖损伤的HEPG2及PLC细胞中circDDX21的相对表达增加。

3. 通过背靠背引物sanger/ACT-D/R酶消化/FISH/核质分离实验结果验证了circDDX21的环状结构/胞质定位及是一种在缺糖损伤诱导参与糖酵解途径的circRNA。

图1. 高通量测序鉴定缺糖损伤相关的circRNA

C-Myc在缺糖诱导DDX21中的作用

1. 作者发现缺糖损伤处理后的HEPG2、PLC细胞不仅诱导了circDDX21的表达，还升高了pre-DDX21 的转录水平，推测circDDX21的生成和转录有关，通过调用JASPAR数据库分析DDX21基因的启动子及内含子区域，预测到了三种转录因子的结合基序：YY1、c-Myc和NRF1，先前的报道中它们参与细胞功能及代谢调节。

2. 通过干扰实验发现，敲低c-Myc可显著降低缺糖诱导下HEPG2细胞中circDDX21的表达。

3. 为了确定c-Myc是否上调circDDX21的表达，通过CHIP/荧光素酶报告实验及JASPAR、ENCODE数据库预测发现了几个潜在的互作位点，其中BS3位点有显著富集，通过设计荧光素酶报告基因载体及敲低实验证明了c-Myc在缺糖诱导中上调circDDX21的表达。

图2. c-Myc在缺糖诱导中驱动circDDX21的产生

circDDX21通过增加PGAM1表达促进糖酵解

1. 作者进一步设计敲低和过表达实验发现circDDX21可以导致HEPG2细胞的糖酵解速率降低/升高。

2. 利用碳13标记葡萄糖进行糖酵解示踪分析表明，在敲低circDDX21后，碳13标记的葡萄糖/丙酮酸、乳酸水平显著升高/降低。

3. 为了进一步探究敲低circDDX21对糖酵解的调控机制，发现特异性敲低了PGAM1的蛋白水平，而不影响其他蛋白的表达水平。

4. 同时circDDX21是否通过调节PGAM1促进糖酵解，作者设计了回补实验，在HEPG2细胞中敲低circDDX21后回补PGAM1后，糖酵解的速率升高。并在过表达circDDX21及敲低PGAM1后降低糖酵解速率。

5. 综上，circDDX21通过增加PGAM1的表达来促进糖酵解。

图3. circDDX21通过增加PGAM1表达促进糖酵解

circDDX21与PABPC1协同作用增加PGAM1 mRNA的稳定性

1. 作者通过敲低/过表达/FISH/核质分离/act-D实验说明circDDX21对PGAM1 mRNA具有调控稳定作用。并进一步通过RAP pulldown/质谱实验选定了3个候选蛋白ENO1、UPF1及PABPC1。发现敲低PABPC1导致PGAM1的mRNA和蛋白水平降低。

2. 通过RAP pulldown/RIP实验进一步验证了PABPC1可以与circDDX21、PGAM1结合。并利用体外合成的正义及反义circDDX21探针与纯化FLAG-PABPC1蛋白与抗FLAG M2磁珠结合，发现PABPC1可直接与circDDX21结合。

3. 作者通过敲低/过表达/回补实验证明了PABPC1可以回补由circDDX21敲低引起的PGAM1的mRNA及蛋白水平的下调。

4. 与WT circDDX21相比，mut circDDX21对PGAM1的mRNA与蛋白水平没有明显影响。

5. 同时利用RIP实验表明，敲低/过表达circDDX21会下调/上调PABPC1与PGAM1的结合。

6. 以上数据进一步表明circDDX21通过PABPC1对PGAM1的表达起到调控作用。

图4. circDDX21与PABPC1协同增加PGAM1的稳定性

circDDX21通过抑制MKRN3介导的PABPC1泛素化来增加PABPC1与PGAM1 mRNA 的结合

1. 先前的研究表明MKRN3介导的泛素化会减弱PABPC1与靶mRNA的结合。因此，作者推测circDDX21是否可以调节PABPC1的泛素化水平，通过体内泛素化实验，发下过表达/敲低circDDX21会下调/上调PABPC1的泛素化水平。进一步探究circDDX21对PABPC1泛素化的抑制作用是否依赖MKRN3的表达，设计了过表达/敲低circDDX21/Flag-MKRN3实验表明circDDX21抑制MKRN3来调控PABPC1的泛素化水平。

2. 进一步通过检测PGAM1的表达水平发现，circDDX21通过抑制MKRN3介导的PABPC1泛素化水平来增强PABPC1与PGAM1的结合。

3. 作者进一步探索了circDDX21如何抑制MKRN3介导的PABPC1的泛素化，通过RIP实验证明，MKRN3与PABPC1的相互作用受到circDDX21过表达/敲低的影响，并通过数据表明circDDX21与MKRN3竞争结合PABPC1的C-端区域（aa:381-636），从而破坏MKRN3-PABPC1的结合并抑制MKRN3介导的PABPC1泛素化。

图5. circDDX21通过抑制MKRN3介导的PABPC1泛素化，增加PABPC1与PGAM1mRNA的结合

circDDX21在肝细胞癌发生中的生物学意义

1. 鉴于circDDX21在肝癌细胞中所参与的糖酵解途径，进一步验证了circDDX21对HEPG2细胞增殖的影响，circDDX21的敲低/过表达后导致HEPG2细胞增殖和克隆数量下降/升高，这些数据表明，CircDDX21通过PGAM1促进肝癌细胞的增殖。

2. 进一步通过过表达/敲低PABPC1实验表明PABPC1在介导circDDX21对细胞增殖促进发挥重要作用。

3. 以上数据暗示了circDDX21通过PCBPC1-PGAM1轴来调控细胞增殖中的潜在作用。

4. 通过小鼠的异种移植模型实验发现，敲低/过表达/回补circDDX21可以抑制/促进/恢复肿瘤的生长。以上数据表明circDDX21通过PGAM1促进体内肝癌细胞的生长，进一步验证了circDDX21在肝癌细胞中的临床意义。

5. 综上所述，这些数据有力地支持circDDX21在肝细胞癌中作为一种致癌circRNA发挥重要的作用。

图6. circDDX21作为一种致癌circRNA促进肝细胞癌变

总结

在本研究中，作者发现确定了circDDX21是缺糖损伤诱导的circRNA。在功能上，circDDX21通过增加PGAM1表达促进糖酵解。机制上，circDDX21通过抑制MKRN3介导的PABPC1泛素化，增加PABPC1与PGAM1 mRNA的结合，从而增强PGAM1 mRNA的稳定性。此外，circDDX21作为一种致癌circRNA，可促进肝细胞癌的进展。综上所述，这些发现提示缺糖损伤诱导的circDDX21在糖酵解调控中发挥重要作用，并揭示了circDDX21在促进肝细胞癌变中的关键作用。

2023年12月4日，徐州医科大学附属医院普外科任泽强/张蓬波团队在Molecular Cancer（IF=37.3）发表文章hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma。结果显示，作者在胰腺导管腺癌预后较差的患者中鉴定到了高表达的hsa_circ_00007919，并以一种依赖LIG1的表达来抑制GEM诱导的DNA损伤、DNA的断裂积累和细胞凋亡来维持细胞的存活以提高对GEM的耐药性，揭示了hsa_circ_0007919为治疗PDAC提供了新的潜在靶点。

一、hsa_circ_0007919在GEM耐药PDAC中表达上调，预测预后不良

作者通过NGS测序对三对GEM耐药/敏感的PDAC组织中检测了特异表达的circRNA，共筛选了62个差异表达的circRNA（FC<-1 或 FC>1, P<0.05）,其中hsa_circ_0007919在GEM耐药的PDAC组织中显著上调。随后通过对耐药/敏感组织的qPCR/sanger测序/背靠背特异性验证/R酶消化进一步验证了它是环状表达的。同时通过总生存期（overall survival, OS）及无病生存期（disease-free survival，DFS）的关系分析表明，hsa_circ_0007919高表达预示OS和DFS较差，同时对接受GEM治疗的PDAC患者中发现，hsa_circ_0007919高表达与OS和DFS较差呈正相关关系。

图1. 高通量测序鉴定GEM耐药的PDAC中相关的circRNA

二、hsa_circ_0007919抑制DNA损伤和吉西他滨敏感性

作者通过对GEM耐药的PDAC组织中鉴定到了hsa_circ_0007919上调，进一步研究了hsa_circ_0007919其在GEM耐药细胞中的功能。首先通过干扰/GEM抗性细胞系筛选实验发现抑制hsa_circ_0007919的表达增加了细胞对GEM的敏感性，且在GEM抗性细胞系中高表达。并进一步通过敲低/过表达/CCK8/流式/DNA Ladder实验实验表明hsa_circ_0007919下调/上调分别降低/增高了细胞增殖并增加/降低了细胞凋亡。与细胞凋亡的检测结果一致的是：hsa_circ_0007919下调/上调分别增加/降低半胱氨酸蛋白酶3和9cleaved caspase 3和cleaved caspase 9及降低/增加了BCL2的表达。

图2. hsa_circ_0007919抑制GEM耐药PDAC细胞的吉西他滨敏感性和凋亡

同时作者进一步评估了hsa_circ_0007919对DNA损伤的影响，hsa_circ_0007919下调/上调分别增加/减少了单细胞凝胶电泳中出现拖尾现象及增加/降低了H2AX的磷酸化（γH2AX）的荧光强度，表明DNA出现损伤。进一步利用小鼠的异种移植模型，发现hsa_circ_0007919沉默的PANC-1/GEM和CFPAC-1/GEM细胞所形成的肿瘤体积和重量均小于对照组。并通过IHC/TUNEL assay/qPCR检测发现hsa_circ_0007919沉默可降低Ki-67的表达，并增加caspase 3和γH2AX的表达及促进细胞凋亡。这些结果表明，hsa_circ_0007919可通过减少DNA损伤，促进细胞增殖及减少细胞凋亡，从而增强细胞对GEM的抗性。

图3. hsa_circ_0007919抑制GEM耐药细胞DNA损伤及促进体内肿瘤增殖

三、hsa_circ_0007919通过LIG1介导的修复途径抑制DNA损伤

作者为了进一步研究hsa_circ_0007919如何抑制DNA并影响PDAC细胞对GEM的敏感性，通过RNA-seq鉴定了hsa_circ_0007919干扰后的差异基因表达（520个显著上调及219个显著下调的基因），并通过KEGG和GSEA分析显示这些基因多中在DNA损伤修复途径进行表达。其中LIG1是下调最明显的基因，此前报道该基因在DNA重组中发挥重要作用。并发现LIG1在GEM耐药PDAC组织中高表达，与hsa_circ_0007919高表达呈正相关趋势，并通过干扰/过表达hsa_circ_0007919发现LIG1的mRNA/蛋白表达水平被下调/上调。这些结果表明，hsa_circ_0007919诱导LIG1表达激活DNA损伤修复途径，增强PDAC细胞对GEM的抗性。

图4. hsa_circ_0007919通过LIG1介导的DNA损伤修复途径调控PDAC的GEM耐药性

四、LIG1逆转了hsa_circ_0007919对细胞增殖、凋亡和DNA损伤的影响

作者为了证实LIG1是hsa_circ_0007919的下游靶点，通过干扰LIG1的表达发现会影响PDAC细胞增殖减少，但细胞凋亡和DNA损伤增加，同时过表达LIG1也会回补hsa_circ_0007919被干扰后影响的细胞增殖、凋亡和DNA损伤现象。这些结果表明，hsa_circ_0007919通过增加LIG1的表达，促进细胞增殖，减少细胞凋亡和DNA损伤。

图5. LIG1回补了干扰hsa_circ_0007919的表达对细胞增殖、凋亡和DNA损伤效应

五、hsa_circ_0007919结合FOXA1和TET1促进LIG1转录

作者为了研究hsa_circ_0007919如何调控LIG1的表达，通过FISH/核质分离实验发现hsa_circ_0007919主要分布在细胞核中，利用circAtlas和SPP数据库绘制了韦恩图确定了FOXA1与hsa_circ_0007919结合及LIG1启动子结合的最显著的蛋白，并进一步利用STRING数据库预测了FOXA1的互作蛋白TET1。在前人研究中报道FOXA1可作为多种癌症中的转录因子；TET1作为DNA甲基化酶来降低基因的启动子甲基化水平并促进其转录。因此，作者进一步预测hsa_circ_0007919与FOXA1、TET1结合来促进LIG1的转录。通过干扰FOXA1及TET1/CO-IP实验发现LIG1的表达降低及FOXA1及TET1之间具有相互作用。进一步在干扰FOXA1的基础上干扰TET1，发现LIG1的表达降低，相反，过表达TET1可以回补FOXA1对LIG1的抑制作用，这表明了FOXA1和TET1可以协同调控LIG1的表达。并设计了ChIRP/RIP实验证实了hsa_circ_0007919可与FOXA1和TET1结合互作。

图6. hsa_circ_0007919在GEM耐药 PDAC细胞中结合FOXA1和TET1调控LIG1的表达

为了研究FOXA1、TET1与LIG1启动子之间的相互作用，作者使用JASPAR和MethPrimer 2.0数据库分析了FOXA1与LIG1启动子的结合位点及预测了LIG1启动子中的CpG岛，进一步选取了启动子区域-1411至-1273的区域进行分析，同时发现利用5-杂氮胞苷5-AzaC处理增加了GEM耐药细胞中LIG1的表达；同时ChIP实验结果也证明了FOXA1和TET1与LIG1启动子区的P1结合；通过荧光素酶报告基因实验发现下调/上调hsa_circ_0007919、FOXA1或TET1会降低/增强LIG1启动子的转录。这些结果进一步表明hsa_circ_0007919通过结合FOXA1和TET1增强了LIG1的转录。

图7. hsa_circ_0007919招募FOXA1和TET1调控LIG1的转录

六、GEM通过增强QKI介导的反向剪切诱导hsa_circ_0007919的表达

据前人报道称，QKI和FUS/ADAR1可以促进/抑制circRNA的行成，作者为了进一步分析hsa_circ_0007919高表达的原因，发现QKI和FUS/ADAR1与hsa_circ_0007919表达呈现正相关/负相关。在GEM耐药细胞中感染QKI的表达，会诱导hsa_circ_0007919的表达下调。同时针对QKI会与pre-mRNA中的内含子结合介导circRNA的形成，通过RIP实验结果显示，在GEM抗性的PDAC细胞中，intron2及16的富集表达增加，这些结果表明GEM通过介导QKI与hsa_circ_0007919的侧翼内含子之间互作，来促进hsa_circ_0007919的环化形成及表达。

图8. GEM通过增强QKI介导的反向剪切诱导hsa_circ_0007919的表达

小结

作者描述了GEM增强QKI介导的hsa_circ_0007919剪切及环化模式，并揭示hsa_circ_0007919可以通过招募FOXA1和TET1来调节LIG1的转录及调控DNA损伤修复途径，这些机制有助于理解hsa_circ_0007919可作为下一个PDAC治疗的潜在靶点。

图9. GEM通过增强QKI介导的反向剪切诱导hsa_circ_0007919的分子调控机制

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2024年3月9日，南方医科大学南方医院泌尿外科谭万龙教授团队研究发现在Molecular Cancer（IF=37.3）发表文章：Bladder-cancer-derived exosomal circRNA_0013936 promotes suppressive immunity by up-regulating fatty acid transporter protein 2 and down-regulating receptor-interacting protein kinase 3 in PMNMDSCs。本研究表明在PMN-MDSCs中，BCa来源的外泌体circRNA_0013936通过
circRNA_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circRNA_0013936/ miR-301b-3p/CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫。这些发现有助于为人类膀胱癌的临床治疗找到新的靶点。

PMN-MDSCs浸润性膀胱肿瘤组织中FATP2和RIPK3的表达

作者采用免疫荧光法检测肿瘤组织中PMN-MDSCs的浸润情况。双阳性细胞（CD11b+/LOX-1+）被标记为PMN-MDSCs。免疫组化显示FATP2和RIPK3的表达。图1A显示肿瘤组织中存在大量的PMN-MDSCs。肿瘤组织中FATP2的表达显著上调，而RIPK3的表达显著下调（图1B-C）。统计分析结果显示，膀胱肿瘤组织中PMN-MDSCs的浸润与FATP2的表达呈正相关，与RIPK3的表达呈负相关（图1D-E）。免疫组化结果显示，LOX-1和FATP2在人膀胱肿瘤组织中的表达高于癌旁组织，而RIPK3的表达低于癌旁组织（图1F）。此外，与I/II期患者相比，III/IV期患者在肿瘤组织中FATP2高表达，RIPK3低表达（图1G）。

图1 PMN-MDSCs浸润肿瘤微环境，过表达FATP2，低表达RIPK3

BCa衍生的外泌体上调PMN-MDSCs中的FATP2，下调RIPK3

透射电镜显示，BCa衍生的外泌体具有完整的、连续的双层膜，这是外泌体的典型形态学特征（图2A）。与PMN-MDSCs共培养后，用荧光PKH67标记的BCa衍生的外泌体被PMN-MDSCs内化（图2B）。当PMN-MDSCs与BCa来源的外泌体共培养时，PMN-MDSCs中FATP2的表达显著上调，而RIPK3的表达显著下调（图2C-D）。LC-MS分析显示，BCa衍生的外泌体促进了PMN-MDSCs中脂质代谢分子（PGE2、TG、AA）的合成（图2E）。此外，ELISA分析显示，BCa衍生的外泌体促进了PMN-MDSCs中免疫抑制分子（IL-10、iNOS、Arg-1）的合成（图2F）。

图2 BCa衍生的外泌体上调PMN-MDSCs中的FATP2，下调RIPK3

circRNA_0013936在BCa衍生的外泌体中的鉴定和表征

作者采用高通量测序来鉴定BCa衍生的外泌体中差异表达的环状RNA。其中，环状RNA表达上调比下调的环状RNA更普遍（图3A）。作者选择了10个上调最多的环状RNA。根据RNA测序和qRT-PCR结果，hsa_circ_0013936是表达差异最大的上调的circRNA（补充图2C）。图3B显示了circRNA_0013936的形成。qRT-PCR显示，与正常尿路上皮细胞来源的外泌体相比，三种BCa细胞来源的外泌体中circRNA_0013936的表达显著上调（图3C）。此外，作者还设计了聚合引物和发散引物来扩增circRNA_0013936。以UMUC3和T24细胞系的cDNA和gDNA（基因组DNA）为模板，仅在cDNA中使用发散引物扩增到circRNA_0013936，gDNA中未见扩增产物（图3D）。通过qRT-PCR，作者进一步证实了circRNA_0013936对RNase R具有耐受性（图3E）。FISH分析显示，circRNA_ 0013936主要位于膀胱肿瘤细胞的细胞质中（图3F）。

图3 circRNA_0013936的鉴定和表征

CircRNA_ 0013936在PMN-MDSCs中上调FATP2，下调RIPK3

为了证实circRNA_0013936可以在PMN-MDSCs中上调FATP2的表达，下调RIPK3的表达，作者用circRNA_0013936模拟物转染了PMN-MDSCs。Western blot结果显示，circRNA_0013936模拟物显著上调了PMNMDSCs中FATP2的表达，下调了RIPK3的表达（图4A-B）。ELISA分析显示，circRNA_0013936模拟物促进了PMN-MDSCs中免疫抑制细胞因子（Arg-1、IL-10、iNOS）的合成（图4C）。LC-MS分析显示，circRNA_0013936模拟物增加了PMN-MDSCs中脂质代谢分子（AA、TG、PGE2）的水平（图4D）。

图4 CircRNA_ 0013936在PMN-MDSCs中上调FATP2，下调RIPK3

CircRNA_ 0013936可以作为miR-320a和miR-301b-3p的海绵

为了研究circRNA_0013936是否可以在PMN-MDSCs中海绵化miRNA，作者通过CircInteractome数据库以及荧光素酶报告基因分析实验，发现了3个候选miRNA（图5A）。然后使用生物素化circRNA探针下拉PMN-MDSCs中的circRNA_0013936（图5B）。RIP实验发现circRNA_0013936、miR-320a和miR- 301b-3p特异性富集，表明miR-320a和miR- 301b-3p是PMN-MDSCs中与circRNA_0013936相关的miRNA（图5C）。图5D显示了miR-320a和miR-301b-3p在PMN-MDSCs中的基本表达情况。为了进一步证实miR-320a和miR-301b-3p是否能与circRNA_0013936结合，作者在293T细胞中进行了双荧光素酶报告实验。结果显示，miR-320a和miR-301b-3p mimic均显著降低了WT-circRNA_0013936的荧光素酶活性（图5E-G）。这些结果表明，circRNA_0013936可作为miR- 320a和miR-301b-3p的海绵发挥作用。

图5 CircRNA_ 0013936可作为miR-320a和miR-301b-3p的海绵

JAK2是miR-320a的直接靶基因，而CREB1是miR-301b-3p的直接靶基因

为了进一步探索其潜在机制，作者利用Targetscan、miRDB、DIANA-microT和Starbase预测miR-320a和miR-301b-3p的靶基因。此外，作者通过RNA测序分析了PMN-MDSCs（circ_0013936-sh vs. circ_0013936-nc）中的差异基因表达。根据RNA测序结果和对靶基因的预测，作者发现miR-320a和miR-301b-3p的下游靶基因分别有9个基因和7个基因（图6A和G）。然后，通过qRT-PCR来验证候选基因。在含有miR-320a保守结合位点的基因中，JAK2在PMN-MDSC-lv-circ_0013936中上调，在PMN-MDSC-sh-circ_0013936中下调（图6B）。在含有miR-301b-3p保守结合位点的基因中，CREB1在PMN-MDSC-lv-circ_0013936中上调，在PMN-MDSC-sh-circ_0013936中下调（图6H）。

此外，双荧光素酶报告基因检测显示，miR-320a模拟物显著降低了JAK2野生型的活性，但没有降低JAK2突变体的活性（图6C-D），miR-301b-3p模拟物显著降低了CREB1野生型的活性，但没有降低CREB1突变体的活性（图6J-K）。此外，如图6J-K和L-M所示，在转染miR-320a/miR-301b-3p模拟物或miR-320a/miR-301b-3p抑制剂的PMN-MDSCs中，JAK2和CREB1的表达在mRNA和蛋白水平上均显著上调或下调。

图6 JAK2是miR-320a的直接靶基因，而CREB1是miR-301b-3p的直接靶基因

CircRNA_0013936通过
circ_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circ_0013936/ miR-301b-3p/ CREB1通路下调RIPK3

CircRNA_0013936通过促进PMN-MDSCs中JAK2的表达来增加FATP2的表达，这一作用可被miR-320a模拟物逆转。circRNA_0013936的敲低通过降低JAK2的表达来抑制FATP2的表达，而miR-320a抑制剂可以逆转此现象（图7A-C）。CircRNA_0013936通过增加CREB1的表达来抑制PMN-MDSCs中RIPK3的表达，这一作用可被miR-301b-3p模拟物逆转。相反，敲低CircRNA_0013936会通过降低CREB1的表达促进RIPK3的表达，而miR-301b-3p抑制剂可逆转这一现象（图7H-J）。qRT-PCR和Western blot分析结果显示，敲低JAK2或CREB1可显著下调FATP2的表达或上调RIPK3的表达，并这一现象可通过过表达JAK2或CREB1来逆转（图7D-F和K-M）。CircRNA_0013936促进了PMN-MDSCs衍生的细胞因子（Arg-1、IL-10、iNOS、AA、TG、PGE2）的产生，这一作用可被miR-320a或miR-301b-3p模拟物逆转。而敲低circRNA_0013936则抑制了PMN-MDSCs衍生的细胞因子的产生，这可被miR-320a或miR-301b-3p抑制剂所逆转（图7G和N）。综上所述，circRNA_0013936通过海绵化miR-320a和miR-301b-3p来调控FATP2和RIPK3的表达。

图7 CircRNA_0013936通过miR-320a/JAK2和miR-301b-3p/CREB1通路上调FATP2和下调RIPK3

在PMN-MDSCs中，外泌体circRNA_0013936通过
circ_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circ_0013936/ miR-301b-3p/ CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫

为了研究BCa衍生的外泌体circRNA_0013936是否通过miR-320a/JAK2和miR- 301b-3p/CREB1通路调控PMN-MDSCs中FATP2和RIPK3的表达，作者使用CRISPR-Cas9基因组编辑系统生成了circRNA_0013936敲除膀胱癌细胞。然后，作者检测了与BCa-外泌体或circRNA_0013936-KO-Bca-外泌体共培养的PMN-MDSCs中FATP2和RIPK3的表达。图8A-B，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936海绵化miR-320a，通过激活JAK2/pSTAT5通路促进FATP2的表达，而circRNA_0013936-KO-外泌体则表现出相反的作用。同时，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936海绵化miR-301b-3p，然后通过激活CREB1通路抑制RIPK3的表达，而circRNA_0013936-KO-外泌体则表现出相反的作用（图8D-E）。最终，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936促进了PMN-MDSCs的免疫抑制细胞因子的产生（图8C，F）。

为了研究BCa来源的外泌体circRNA_0013936是否通过调节PMN-MDSCs中的FATP2和RIPK3来影响CD8+ T细胞的功能，作者将CD8+ T细胞与BCa来源的外泌体或circRNA_0013936-KO-BCa-外泌体诱导的PMN-MDSCs共培养。流式细胞术和CFSE分析结果显示，BCa来源的外泌体通过调节FATP2和RIPK3的表达，显著抑制了IFN-γ的产生和CD8+ T细胞的增殖功能，而circRNA_0013936-KO-BCa-外泌体则表现出相反的作用（图8G-H）

图8 在PMN-MDSCs中，外泌体circRNA_0013936通过miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过miR-301b-3p/CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫

小结

在BCa衍生的外泌体中富集的CircRNA_0013936可以促进FATP2的表达，并抑制PMN-MDSCs中RIPK3的表达。在机制上，circRNA_0013936通过海绵化miR-320a和miR-301b促进RIPK2的表达，而miR-301b分别直接靶向JAK2和CREB1，抑制RIPK3的表达。最终，circRNA_0013936在PMN-MDSCs中，通过
circRNA_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circRNA_0013936/miR-301b/CREB1通路下调RIPK3，显著抑制CD8+ T细胞的功能。结果表明，circRNA_0013936有望成为BCa的有效治疗靶点。这些发现为膀胱癌的临床治疗提供了理论基础和新的思路。

2024年2月21日，汕头大学医学院附属肿瘤医院陈创珍团队在JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH（IF=11.3）发表文章A tumor suppressor protein encoded by circKEAP1 inhibits osteosarcoma cell stemness and metastasis by promoting vimentin proteasome degradation and activating anti-tumor immunity。结果显示，作者通过微阵列分析技术鉴定OS与正常组织之间差异表达的circKEAP1（hsa_circ_0049271），在OS肿瘤中的表达下调，并与癌症患者更好的生存率相关。进一步分析发现circKEAP1含有777 nt长的ORF，并编码的新蛋白KEAP1-259aa。从机制上讲，KEAP1-259aa可通过与E3连接酶ARIH1相互作用促进波形蛋白酶体降解以此抑制OS细胞的增殖、侵袭。此外，circKEAP1与RIG-I相互作用，通过IFN-γ途径激活抗肿瘤免疫，为OS治疗提供了新的潜在靶点。

一、circKEAP1在OS组织中特异低调

作者通过3对OS及正常组织进行微阵列分析，并鉴定了一系列的差异表达的circRNA，通过GO富集分析，选择前5个差异表达的circRNA，并通过qPCR/divergent primer sanger测序/R酶消化富集实验及GEO数据库中发现circKEAP1(hsa_circ_0049271)是OS中明显低调及确定是反向剪切形成稳定的circRNA结构。其次作者通过核质分离及FISH实验检测到circKEAP1主要定位在细胞质中，同时卡普兰-迈尔生存分析（Kaplan-Meier survival analysis）/ROC曲线分析发现circKEAP1表达水平较高的OS患者的总体生存时间更长，circKEAP1可作为诊断OS的候选标志物。

图1. 微阵列分析鉴定OS相关的circRNA

二、circKEAP1抑制OS细胞的增殖、迁移和干性

作者通过CCK8/克隆形成/流式检测/细胞划痕/Transwell侵袭发现circKEAP1抑制OS细胞的增殖并增加了OS细胞的凋亡，进一步证实了对OS细胞迁移的抑制。同时使用异种移植模型/IHC说明了circKEAP1降低了OS细胞肺转移的感染能力并减弱肿瘤的生长。

图2. circKEAP1的表征及其在OS中的功能

三、circKEAP1可编码蛋白 KEAP1-259aa

作者进一步通过circRNADb数据库预测circKEAP1有一个777长度的ORF，可编码一个259aa的蛋白，并通过构建双荧光素酶/过表达FLAG标签载体/敲低载体/液相色谱-质谱/免疫荧光验证了circKEAP1的IRES活性和蛋白表达。同时使用KEAP1商业化抗体检测了8对OS组织发现与正常组织相比，OS组织中的KEAP1-259aa的表达水平较低。

图3. circKEAP1编码一种新型蛋白质推测起在OS中发挥的机制

四、新蛋白KEAP1-259aa发挥肿瘤抑制作用

作者进一步分析KEAP1-259aa的生物学功能，通过过表达circKEAP及IRES、ATG突变载体/CCK8/流式检测/细胞划痕/Transwell侵袭，发现KEAP1-259aa抑制OS细胞的增殖和克隆形成及调节细胞迁移能力，并通过流式/WB检测相关干细胞标志物的下调及肿瘤球形成试验/裸鼠皮下注射实验发现该蛋白可抑制肿瘤的形成。

图4. KEAP1-259aa可抑制OS细胞的增殖、侵袭和干性

五、KEAP1-259aa通过与E3连接酶ARIH1结合促进波形蛋白酶体降解

作者为了进一步探究KEAP1-259aa抑制OS恶性肿瘤的分子机制，开展了基于质谱的甲醛交联实验，通过GO富集分析表明KEAP1-259aa结合蛋白与翻译后修饰有关，其中最显著的是vimentin波形蛋白和泛素转移E3连接酶ARIH1，并通过CO-IP/免疫荧光染色实验进一步验证它们之间的互作。作者也发现了过表达KEAP1-259aa降低了波形蛋白的表达水平，与对照相比，波形蛋白的降解速度更快，但是用CHX处理（蛋白质合成抑制剂），敲低ARIH1恢复了波形蛋白的表达。此外，KEAP1-259aa介导的波形蛋白稳定性下降被蛋白酶体抑制剂MG132逆转。同时用HA抗体检测GFP ip下的蛋白发现，KEAP1-259aa诱导了波形蛋白的泛素化水平修饰。为了进一步测试KEAP1-259aa介导的波形蛋白的泛素降解是否与其磷酸化水平有关，构建了波形蛋白的野生型及丝氨酸突变型载体，IP实验结果显示KEAP1-259aa对39aa突变位点的波形蛋白的泛素化调节水平降低。

图5. KEAP1-259aa与ARIH1相互作用促进波形蛋白降解

六、circKEAP1通过vimentin发挥抑瘤作用

作者用WFA处理OS细胞后，circKEAP1敲低明显抑制细胞的增殖、集落形成、迁移和干性均降低，细胞凋亡增强。此外，在体内和体外用vimentin转染细胞时，circKEAP1没有发挥抑瘤作用。综上所述，这些发现表明circKEAP1编码的KEAP1-259aa通过抑制vimentin发挥肿瘤抑制作用。

图6. circKEAP1通过降低波形蛋白水平抑制OS恶性肿瘤

七、circKEAP1的m6A甲基化修饰调控作用

作者为了探索控制OS中circKEAP1水平的详细机制，进一步用SRAMP预测了m6A位点（A565G），RNA pulldown和RIP实验表明，circKEAP1可以与m6A甲基化修饰因子：METTL3、FTO和YTHDF1/2相互作用，并在circKEAP1在A565上存在m6A修饰位点，并通过降低其甲基化时的稳定性来调节circKEAP1的表达。

图7. circKEAP1的表达受m6A甲基化调节

八、circKEAP1在OS细胞中通过RIG-I通路触发免疫防御反应

作者为了深入研究circKEAP1在OS中的下游调控机制，进行了RNA-seq，通过GO和KEGG/GSEA富集分析/qRT-PCR发现circKEAP1参与I型干扰素(IFN)和免疫信号传导。之前的研究发下RIG-1的缺失与癌症免疫逃逸有关，通过敲低RIG-1发现circKEAP1诱导的免疫通路相关基因表达水平下调；同时用WB/ELISA/人炎症因子抗体芯片发现circKEAP1可促进RIG-1、p-IRF3、CXCL10、CCL5等免疫调节因子的表达。进一步通过RIP/FISH实验，circKEAP1可通过自身的CARD结构域与RIG-1结合，并共定位在细胞质中，这些结果表明circKEAP1的过表达通过 RIG-1来调控OS中相关免疫基因的上调。

图8. CircKEAP1通过RIG-I激活细胞免疫应答

总结

作者通过一系列实验证明了circKEAP1可以抑制肿瘤的生长、侵袭和增殖，并通过编码一个新型蛋白KEAP1-259aa，其与波形蛋白结合并通过与ARIH1相互作用促进波形蛋白降解。更重要的是，circKEAP1通过RIG-I信号通路激活抗肿瘤免疫。这些结果表明circKEAP1是OS中的一个重要治疗靶点。

图9. circKEAP1可在OS细胞中的调控机制

参考文献

[1] Soghli N, Qujeq D, Yousefi T, Soghli N. The regulatory functions of circular RNAs in osteosarcoma. Genomics. 2020;112(4):2845–56.

[2] Wu Y, Xie Z, Chen J, Chen J, Ni W, Ma Y, Huang K, Wang G, Wang J, Ma J, et al. Circular RNA circTADA2A promotes osteosarcoma progression and metastasis by sponging miR-203a-3p and regulating CREB3 expression. Mol Cancer. 2019;18(1):73.

一、简介

熟悉组学分析的小伙伴们都知道，基因集富集分析（GSEA）是绕不开的话题，它是另一种用于基因集合功能探究的方法。GSEA的可视化图类型相对较少，下图即是其中一种展示方式：

这张图看起来十分高级，层层堆叠的曲线，如同一座座连绵的小山，我们可以将其称为“山脊图”。本质上，它是一种密度图，以一条中心线为基准，两侧呈现出数据的分布情况。这张图为我们展示了基因集之间的富集情况以及富集通路的核心富集基因的表达分布情况。在基因集富集分析中，通常核心富集基因会在某个表达水平上集中分布，在这种情况下就会形成类似于正态分布的曲线，从而展现出“山脊”的模样。通过观察山脊图，我们可以直观地了解核心基因在不同通路中的表达水平，从而揭示富集通路的活跃程度和差异。

那这种强大的工具又是出自何手？

熟悉往期推文的朋友可能猜到了，enrichplot——一个非常强大的R包，通过其内置的ridgeplot函数，只需几行代码，就可以生成一个美观而富有信息量的“山脊图”。同时，它还提供了丰富的参数选项，可以根据个人需求进行定制，例如调整线条颜色、线宽、填充类型和颜色等。

二、图解

横轴：

表示富集通路的核心富集基因表达倍数log2转换值的分布范围；

纵轴：

表示各通路中富集基因分布的频率；

图例：

各富集通路的p值，并通过渐变颜色表示值的变化，颜色越红表示越显著。

三、应用

这种“山脊图”在富集通路分析中具有重要的应用价值。通过展示核心基因的表达分布，我们可以更好地理解富集通路的功能和调控机制，这对于生物学研究和药物开发具有重要意义。例如，在癌症研究中，我们可以用来展示与肿瘤相关的富集通路的核心基因的表达分布，从而揭示肿瘤的发生机制和潜在治疗靶点。

轻舟已过万重山，小伙伴们快去“乘舟破浪”吧。

关于enrichplot的详细使用方法请戳：

http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/enrichplot.html

概述

可能大部分环状RNA的研究者都没想到，就算根据标准的环状RNA检验方法，环状RNA仍然会上演“真假美猴王”的剧情。特别是这里的六耳猕猴也非常能打~

前不久才在一篇文章中提到过环状RNA分子识别与验证的标准指南……(lll￢ω￢)

Nature Methods丨大咖组团发表环状RNA检测工具的评估报告以及使用指南

2023年7月27日，台湾省中央研究院的庄树谆教授团队在Nucleic Acids Research（IF=14.9)上发表了一篇关于ts-RNA的文章【Detecting intragenic trans-splicing events from non-co-linearly spliced junctions by hybrid sequencing】。

作者通过整合二代和三代测序数据开发了一个识别基因内ts-RNA的生信工具NCLscan-hybrid，提出了用out-of-circle和rolling-circle特征来区分基因内ts-RNA和circRNA；通过该工具，作者发现环状RNA公共数据库中一些环状RNA可能是ts-RNA，二者都具有相同的序列特征BSJ。为此，作者设计了一系列的实验步骤证实了ts-RNA的存在，排除了环状RNA的可能。此外，作者用 CRISPR/Cas9探索了ts-RNA生物合成的机制，发现和环状RNA一样，侧翼内含子中的互补序列能够促进ts-RNA的形成。最后，作者对其中一个 tsRNA分子ts-ARFGEF1进行了体外和体能的功能实验，发现该分子在乳腺癌细胞中通过影响 PERK/eIF2a/ATF4/CHOP信号通路在p53介导的凋亡过程中扮演着重要角色。

基本概念

要看懂这篇文章，我们首先要了解一些基本概念：

1、共线性与非共线性

2009年Nature发表的Implications of chimeric non-collinear transcripts文章给出了转录中共线性（co-linear）以及非共线性（non-co-linear，NCL）的定义。

所以，环状RNA属于非共线性RNA分子。

2、什么是ts-RNA

RNA剪接发生在一个前体mRNA(pre-mRNA)的分子内部称为cis-splicing；如果发生在两个前体 RNA分子之间，形成杂合的mRNA，那么这种剪接方式就称为trans-splicing。trans-splicing的两个前体RNA可以来自同一基因的同义链，也可以来自正反义链，甚至可以来自不同染色体的两个基因。

ts-RNA即trans-spliced RNA，本篇文章主要研究的是基因内ts-RNA（见下图）。

3、基因内ts-RNA与circRNA

从图中我们可以看出，circRNA实际上是cis-spliced RNA，而基因内的ts-RNA是由同一基因的两条前体RNA拼接而成。

从示意图我们可以看出，基因内ts-RNA也包含 back-spliced junction，文章中称为NCL junction。

早在2018年circRNA公众号就解读过ts-RNA，大家有兴趣可以访问：

Nucleic Acids Research:反向拼接产物也可能是分子间拼接的产物！

检测ts-RNA面临的挑战

由于成熟的ts-RNA包含poly(A)而环状RNA不包含，因此，poly(A)+的二代测序比较适合检测ts-RNA。

然而，基因内ts-RNA的识别仍要面临诸多挑战：

• 目前的二代测序短读长仍存在错误基因组比对的问题；

• 通过二代测序技术难以区分ts-RNA与环状 RNA，特别是它俩可能具有相同的NCL junctions；

• 模板交换事件（template swithching events）等实验产物经常出现在cDNA产物中，可能会被误认为NCL事件；

• DNA水平的遗传重组所形成的NCL也是检测真实 ts-RNA的另一大挑战；

• 目前仍不清楚ts-RNA是否只是pre-mRNA剪切不完善的副产物，或者是否能够介导对应共线性宿主的表达；

• 基因内ts-RNA生物合成仍不清楚。

敢情这种分子比环状RNA检测还要难。

为了解决上面的问题，作者还采用了三代长度长测序。相比二代测序，三代测序在识别ts-RNA具有巨大的优势：

• 避免了短读长测序识别NCL junctions所存在的偏差；

• 能够区分ts-RNA与circRNA。

二代+三代测序检测ts-RNA

作者通过整合二代测序与三代测序数据，开发了 NCLscan-hybrid流程用于检测基因内ts-RNA（如下图）。

NCLscan-hybrid检测ts-RNA的流程：

作者收集了9个环状RNA数据库的基因内的NCL junctions（即之前被识别到的back-spliced junctions）作为候选NCL junction（图A-a），通过total RNA建库以及poly(A)+两种建库方式对 MCF-7细胞系进行测序，然后对候选NCL junction进行定量，只有被两种文库支持的NCL junctions才被保留（图A-b）。

基于被保留的NCL junctions，NCLscan-hybrid 将NCL junction侧翼外显子拼接生成假参考序列，然后将三代测序的reads通过比对到假参考序列上（图A-c，图B）。只有包含三代测序reads的 NCL事件被保留。

随后，包含NCL junction的三代测序reads根据 NCL break points被分割成了两个部分，然后每一部分被比对到GRCh38参考基因组上（图B）。为了最大限度的减少被其他共线性或多重比对带来的假阳性，这里的NCL事件必须满足：被分割两部分的三代测序reads在比对时必须唯一匹配到相同的基因位点。

如果至少有一个分割部分超出了NCL供体或受体的剪接位点，那么这条三代测序的read被称为 “out-of-circle-read”（图B右侧），而这条read所对应的RNA被认定为ts-RNA。

如果一条read包含两个或多个NCL break points，并且不存在”out-of-circle-read”的序列，那么这条read被称为“rolling-circle-read”（图B右侧）。

在这项研究中，作者并没有发现同时包含”out-of-circle-read”以及“folling-circle-read”的事件。

最后，作者识别到了17个来自8个ts-RNA的事件，其中7个事件来自于ts-ARFGEF1。

实验验证ts-RNA

为了排除真实ts-RNA的干扰项，包括：

• 反转录产物，例如模板交换事件（template swithing events）；

• 环状RNA；

• 遗传重组。

作者设计了一系列验证步骤对8个候选ts-RNA进行实验检验（下图是汇总）：

1) 由于反转录产物往往依赖于反转录酶，因此，通过两种不同的反转录酶（逆转录病毒的反转录酶 SSIV和细菌II型内含子反转录酶 Induro）进行并行实验，然后通过sanger测序检测NCL junction。作者发现8个候选ts-RNA都与反转录酶没有关系（A）。

2) 为了区分ts-RNA与circRNA，作者首先对total RNA进行加A尾（A-tailing），然后用RNase R消化（B）。

然而，有许多存在高级结构或G四联体的环状RNA对RNase R耐受。为了解决该问题，作者通过在第10分钟和第90分钟停止Induro反转录酶（具有强烈且稳定的滚换反转录活性）的反转录反应，然后用qPCR检测NCL junction。如果在90min的cDNA产物比10min时更高，那么该NCL junction更可能来自环状RNA（C）。

同时，作者用oligo-dT pull-down检测了这些候选分子是否包含poly(A)尾（D）。

为了进一步检测候选分子是线性而非环状，作者通过生物素标记的寡核苷酸检测（biotin-labeled oligonucleotide assay）来捕获线性转录本，并观察与oligo-dT pull-down结果的相似性（E）。

另外，为了证实ts-RNA存在，作者设计了 convergent primer pairs——其中一条引物跨越 NCL junction，另一条落于NCL供体位点外侧——并在多个乳腺癌细胞系对ts-RNA进行检测（F）。

3) 为了验证ts-RNA主要来自转录后而不是遗传重组，作者设计了divergent以及convergent primers对ts-RNA转录本进行扩增。PCR结果显示，divergent primers扩增的产物来自cDNA而不是gDNA，而convergent primers对cDNA和gDNA 都有扩增（G）。

4) ts-ARFGEF1额外验证：

上面一系列验证步骤表明ts-ARFGEF1与ts-TRIM37主要来自trans-splicing，并且ts-ARFGEF1具有较高的out-of-circle比率（如下图）。

因此，作者采用了更多的验证步骤来检验ts-ARFGEF1：

1、反转录产物的排除

作者针对NCL junction设计了锁核酸的反义寡核苷酸（locked nucleic acid-modified antisense oligonucleotides，LNA-ASO），然后用RNase H处理来自MCF-7细胞系的total RNA（H, top），随后qRT-PCR分析对包含NCL junction的转录本进行了检测。RNase H会消化杂交到DNA 上的RNA，而来自反转录的产物表达将不会受严重影响（H，bottom）。

随后，作者采用了两种非反转录的验证方式来检测 ts-ARFGEF1的NCL junction。

– SplintR-qPCR

通过两条探针与NCL junction末端杂交，然后用 SplintR连接酶连接两条探针（I，left）。随后用 ASO对NCL junction进行敲除，并用qPCR进行丰度检测（I，right）。

– RNAFISH

RNA荧光原味杂交显示ts-ARFGEF1主要定位与细胞核中（J），亚细胞组分分析也有同样的结果。

2、排除circRNA

首先设计convergent primers来证实ts-RNA序列跨越了NCL供体和受体位点，然后靶向NCL junction的生物素标记的寡核苷酸来pull down对应的转录本，随后用nanopore对捕获到的分子进行测序（K，top）。

qRT-PCR表明pull down效率较高（K，buttom left），nanopore测序的reads表明89%的reads 属于out-of-circle（K，buttom）。

3、排除遗传重组

针对Intron26和Intron19(L,middle)，作者通过 PCR+Sanger测序证实了短序列的Intron26，然后用长的PCR实验+Nanopore测序证实了长序列的 Intron19(L,left,right)。同时将Nanopore reads比对到Exon26，证实了Intron19确实不包含 Exon26序列。以上结果排除了ts-RNA来自遗传重组的可能。

ts-RNA的起源

已有研究表明ts-RNA的形成与NCL junction侧翼内含子中的反向互补序列（RCS）相关，但目前仍缺少内源性的实验证据。

因此，作者首先检测了ts-ARFGEF1 NCL junction侧翼内含子Intron 19和Intron 26中是否包含RCS，结果发现了一对RCS(A,buttom)。随后，作者用异位表达系统（ectopic expression system）和内源基因组修饰实验（endogenous genome modification experiment）检测RCS是否能够触发ts-ARFGEF1的生物合成。

1、异位表达系统构建

作者将包含Exon26-Intron26-Exon27(WT)与 Exon26-Intron26mut-Exon27(Mut,mutant RCS in intron 26)的区域分别插入到pFLAG-CMV2载体（A，top）。

随后，这两种载体被分别转染到MCF-7细胞中，随后用带有FLAG跨junction的primer FLAG-Exon26-Exon20对ts-ARFGEF1的表达进行监控。结果显示，FLAG-Exon26-Exon20仅在WT 中能够被检测到，而Mut并没有（B）。

用同样的方法，ts-TRIM37表达也被证实能够被 RCS诱导。

2、内源基因组修饰实验

作者用CRISPR/Cas9对Intron 26上的RCS位点进行了突变（C），ts-ARFGEF1的表达显著降低（D）。

随后，作者用高保真的CRISPR/Cas9系统将 Intron 19内的RCS删除了一个碱基（E），同样地，ts-ARFGEF1的表达显著降低（F）。

另外，值得注意的是，通过WB实验我们可以发现，上面的突变/删除实验并没有影响来源基因 ARFGEF1共线性转录本的蛋白表达水平（G）。

所有这些结果证明了侧翼内含子上的RCS对能够调控ts-ARFGEF1 NCL junction的形成。

ts-ARFGEF1的功能

作者发现ts-ARFGEF1在MCF-7以及MDA-MB-157两种乳腺癌细胞系中特异的表达，但在非肿瘤上皮乳腺细胞系MCF-10A和HBL-100中不表达（如下图）。

因此，作者怀疑ts-ARFGEF1在乳腺癌细胞中具有功能。为此，作者设计了LNA-ASO来靶向它的 NCL junction，试图在两种乳腺癌细胞中沉默ts-RNA（A），并通过以下三种实验来验证ts-ARFGEF1的功能。同时，WB结果显示，这种敲低并不能影响来源基因ARFGEF1蛋白质的表达（B）。

1、CCK-8 assay

ts-ARFGEF1的敲低显著抑制了MCF-7和MDA-MB-157的增殖能力（C）

2、colony formation assay

ts-ARFGEF1敲低后，细胞克隆形成的数据量和大小显著减少（D-E）

3、flow cytometry

ts-ARFGEF1的敲低能够显著增加两种乳腺癌细胞的凋亡（F-G）

随后，作者想了解ts-ARFGEF1是否是通过编码蛋白发挥功能，因此预测了它的蛋白质编码序列 ——与ARFGEF1蛋白质序列部分重合。然而通过设计N端抗体对其蛋白质进行检测，并没有发现 ts-ARFGEF1具有蛋白质编码能力。

最后，作者试图检测ts-ARFGEF1在体内对肿瘤进展的影响，因此对裸鼠原位注射了control MCF-7 和ts-ARFGEF1-knockdown MCF-7，从而构建异位移植瘤模型。作者发现ts-ARFGEF1-knockdown小鼠中的肿瘤更小。

为了进一步确认ts-ARFGEF1敲低确实能够作为抑制肿瘤的治疗手段，作者先对裸鼠原位注射了 control MCF-7，当肿瘤生长到14天达到~25mm 时，对小鼠通过腹膜注射LNA-ASOs（H）。结果显示，LNA-ASOs注射的肿瘤生长率显著低于 control（I）。而到了接种后的第28天，LNA-ASOs肿瘤的容量以及重量被明显抑制（J-L）。

以上体外以及体内实验表明，ts-ARFGEF1表达被干扰能够显著抑制肿瘤细胞的生长。

ts-ARFGEF1的潜在调控作用

由于ts-ARFGEF1主要定位在细胞核，因此作者怀疑它主要在转录或转录后调控基因的表达。为此，作者对ts-ARFGEF1敲除前后的MCF-7细胞进行了 microarray检测。

GSEA分析的上调和下调的前10个基因集合表明 ts-ARFGEF1敲低主要与细胞压力或细胞死亡信号通路相关，例如p53 signaling、apoptosis、unfolded protein responses(UPR)等（A）。差异分析获得了167个上调和298个下调的基因（B），且与GSEA结果一致，上调基因显著富集到了UPR和p53 signaling（C）。

由于p53是与凋亡相关的著名肿瘤抑制子，且p53 信号通路是凋亡信号通路中主要的通路之一。因此，作者对ts-ARFGEF1敲低进行表达检测，发现 p53蛋白质以及凋亡重要hallmark之一的PARP水解的表达水平都升高了（D），而TP53以及下游通路相关的基因表达都升高了（E）。

UPR是调控细胞内蛋白质稳态的关键通路，在长期或强烈的内质网（ER）应激下，强烈和持续的 UPR激活可引起癌症细胞凋亡。因此，作者试图检测ts-ARFGEF1是否能够调控ER内稳态并导致细胞凋亡。qRT-PCR显示UPR的两个关键基因 TSPYL2和ATF4以及下游效应因子ATF4、ASNS、CHAC1和SLC7A5的mRNA表达水平在 ts-ARFGEF1敲低后显著上调（F）。已知ER过载能够激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路从而诱导凋亡，作者通过WB检测到ts-ARFGEF1敲低后磷酸化后的eIF2α、ATF4以及CHOP蛋白质水平显著上升（G）。为了检测ts-ARFGEF1敲低是否会引起ER应激，作者检测了不正常堆叠蛋白质形成的聚集小体（aggresome），结果显示ts-ARFGEF1敲低的确会引起聚集小体的形成（H）。

以上结果表明ts-ARFGEF1敲低会引起unfolded protein response进而通过激活 PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路诱导细胞凋亡，暗示了ts-ARFGEF1在MCF-7细胞的ER内稳态中具有重要作用。

讨论

从本文我们可以看出，ts-RNA存在且具有重要的生物学功能。值得注意的是，ts-RNA与circRNA 都存在相同的分子特征——类BSJ——NCL junction。因此，在研究ts-RNA或circRNA时需要注意区分两者，特别是那些能够被RNase R消化的circRNA也许是ts-RNA。大家可以参考文章的实验步骤来区分ts-RNA以及circRNA。

文章中的软件NCLscan-hybrid可以访问 https://github.com/TreesLab/NCLscan-hybrid，但需要注意的是，该软件针对的是基因内的ts-RNA，且只能识别包含out-of-circle特征的ts-RNA。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkad623