circRNA与mRNA互作

韩国科学技术院Yoon Ki Kim研究团队揭示了circRNA可通过与mRNA的3′ UTR相互作用，将其携带的外显子连接复合体（EJC）定位在mRNA的3′ UTR附近，从而靶向调控无义介导的mRNA降解(NMD)机制。人工设计的circRNA，可靶向下调mRNA水平，为circRNA在基因沉默和疾病治疗中的潜在应用开辟了广阔前景。^[11]
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肿瘤疫苗类型包括肽/蛋白、树突状细胞(DC)和核酸(包括DNA和RNA疫苗)。其中RNA疫苗可在细胞质内快速表达抗原，从而导致强大的免疫激活，还可避免基因组整合和T细胞耐受性相关风险。加之circRNA的独特优势，可成为极具前景的肿瘤疫苗载体。

斯坦福大学的张元豪和Wender研究团队利用circRNA编码卵清蛋白 (OVA)^[27]，多伦多大学李博文团队利用circRNA编码IL-12^[28]、福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙/赵必星团队利用circRNA编码新抗原PTPN2多肽片段^[29]，结果发现这些circRNA肿瘤疫苗均可在模型体内诱导强烈的抗肿瘤免疫反应，且能强效、安全、稳定抑制肿瘤生长，甚至清除肿瘤，效果显著优于线性mRNA，且无明显副作用。

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中山大学附属第一医院张弩团队联合吉赛生物团队开发表达lncRNA编码肽肿瘤抗原的疫苗circH19-vac，可触发针对胶质母细胞瘤的强效细胞毒性T细胞反应并抑制肿瘤生长。^[30]

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circRNA还有望成为优越的肿瘤抗原载体，开发有效的DC疫苗。吉林大学张海红团队开发编码肿瘤抗原FAPα和survivin的circRNA DC疫苗，可显著抑制肿瘤生长，与吉西他滨药物进行联合治疗，显著延长了胰腺癌小鼠的存活率。^[31]

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图4 circRNA疫苗激活免疫反应。^[32]

CAR-T疗法

环状RNAs是一种单链共价闭合ncRNA，没有5 ‘端帽和3 ‘端poly (a)尾，由前体mRNA自剪切产生，广泛表达于病毒、植物和哺乳动物等多种物种中。环状RNAs在癌症的发生过程中发挥着关键作用，具有作为癌症诊断、预后和治疗的生物标志物的潜力。研究表明，环状RNAs通过与Wnt通路相互作用调节一系列肿瘤微环境中的细胞生物学功能，这些研究为癌症的诊断和治疗提供了新的视角。Wnt通路相关的环状RNAs也成为了许多癌症研究的焦点。

2022年5月5日，浙江大学医学院第一附属医院李兰娟院士在Molecular Cancer上发表题为The functional roles of the circRNA/Wnt axis in cancer的综述文章。环状RNAs在Wnt通路中富集，异常的Wnt通路激活参与了各种类型癌症的发生发展，Wnt通路相关环状RNAs表达与许多临床特征明显相关，环状RNAs可以通过与Wnt通路相互作用来调节细胞的生物学功能。CircRNA/Wnt信号调节癌症相关基因的表达，进而调控癌症的进展，Wnt通路相关的环状RNAs在癌症诊断、预后评估和治疗方面是很有前途的潜在生物标志物。本文就Wnt通路相关环状RNAs在肿瘤发生发展中的作用及临床应用的研究进展进行综述。

一.Wnt通路分类

Wnt基因于1982年首次在小鼠乳腺肿瘤中发现。Wnts是一个分泌的、脂质修饰的蛋白家族，与卷曲受体结合，激活信号级联反应。Wnt通路可分为Wnt/β-catenin信号通路、Wnt/PCP信号通路和Wnt/Ca2 ⁺信号通路三大类（如下图所示）。

Wnt/β-catenin信号通路以β-catenin基因的细胞再分布和核积累为特征。Wnt与卷曲跨膜受体结合，激活蛋白Disheveled (Dsh/DVL)，β-catenin的表达水平增加。上调的β-catenin被转移到细胞核中，核β-catenin与T细胞转录因子(TCF)/淋巴样增强因子(LEF)相互作用，最终激活下游靶基因的表达。Wnt/β-catenin信号通路作为细胞增殖、转移和分化的重要调节剂参与癌症过程。Wnt基因的过表达或导致β-catenin降解的成分之一的突变引起Wnt/β-catenin通路的激活。

Wnt/PCP信号通路中，DSH通过Daam1与下游效应因子Rho和ROCK (Rho相关激酶)相连。RAC直接被Dsh激活，Dsh进一步通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAP3Ks)和MAP2Ks激活JNK。PCP通路与细胞极性、细胞排列和细胞迁移有关。

Wnt/Ca 2 +信号通路中，DSH通过G蛋白激活PLC，这些细胞过程最终可以促进细胞内Ca2 ⁺的释放。DSH的激活也能激活cGMP特异性磷酸二酯酶PDE6，降低细胞内cGMP，导致细胞内Ca2 ⁺浓度升高。细胞质Ca2 ⁺浓度升高可刺激核因子NFAT和其他转录因子。这些过程触发下游通路的激活和一系列细胞功能的改变。Wnt/ Ca2 ⁺通路对早期胚胎发育、神经间通讯和炎症反应至关重要。

Wnt通路三大类

二. 肿瘤中的Wnt通路

1.消化系统肿瘤

食管癌的耐辐射食管癌细胞系circRNA_100367水平升高，circRNA_100367通过调控miR-217/Wnt3通路降低辐射敏感性。CircRNA_100367在活体辐射下也能影响食管癌细胞的生长。

胃癌Wnt通路相关的一些环状RNAs (circ0005654, circ-SFMBT2, circ_SMAD4, circRNA_0044516, circHIPK3)在胃癌中显著上调。circ0005654、circ_SMAD4、circHIPK3和circheckd1的表达与胃癌患者不良预后呈正相关。这些环状RNAs都有助于促进胃癌肿瘤细胞的增殖。Circ-SFMBT2通过上调CTNNB1的表达激活Wnt/βcatenin通路。CircRNA_0044516通过调控miR-149/Wnt1/β-catenin轴影响癌症进展。如图1所示，circCNIH4、circ – ITCH和circ_0001649在胃癌组织和细胞中的表达显著下调。CircCNIH4通过上调DKK2和FRZB水平抑制Wnt/βcatenin通路，Circ-ITCH降低miR-17水平，使Wnt/β-catenin通路失活性，Circ_0001649通过海绵吸收miR‐20a抑制ERK和Wnt/β-catenin信号通路。

图1.Wnt相关环状RNAs在胃癌中的作用机制

结直肠癌中circRNA失调已被发现与CRC的发生发展密切相关。Table1显示CRC中Wnt通路相关的环状RNAs 。

肝癌中circRNA-SORE、circβ-catenin、circZFR和circ_0067934的表达相对升高，可以显著促进细胞增殖。Circ_0067934通过激活miR-1324/FZD5/wnt/β-catenin轴调控HCC细胞行为。另一方面，circ_0004018、circ_0003418和circ-ITCH的表达在HCC中显著下调。Circ_0004018通过靶向miR-626/DKK3轴调控Wnt/β-catenin通路，加速HCC进展。

胰腺癌中骨髓间充质干细胞来源的外泌体circ_0030167通过海绵吸收miR338-5p激活WIF1/Wnt8/β-catenin轴。

消化系统肿瘤中Wnt通路相关环状RNAs

2. 呼吸系统肿瘤—肺癌

肺癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因，包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌，NSCLC占肺癌病例的绝大多数。在NSCLC中，大多数环状RNAs与miRNAs相互作用激活Wnt/β-catenin通路。如图2所示，在肺癌中，circ_0018414通过调控miR-6807-3p/DKK1和Wnt/β-catenin通路抑制癌症进展，circ 0007059通过充当miR-378的海绵来抑制Wnt/β-catenin，circ -ITCH通过海绵化miR-7和miR-214上调ITCH表达，使Wnt/β-catenin信号通路失活。

图2.Wnt相关环状RNAs在肺癌中的作用机制

3. 神经系统肿瘤—神经胶质瘤

恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤。近年来，Wnt通路相关环状RNAs在胶质瘤研究中引起了广泛关注。与正常脑组织相比，在胶质瘤组织中circ_0001730, circKIF4A, circ_0000177和cZNF292水平均上调。circ_0001730作为miR-326的海绵，在胶质瘤的病理生理过程中积极调控Wnt/βcatenin通路。在胶质瘤中，circ_0000177过表达增加FZD7水平，激活miR-638介导的Wnt信号通路。

4. 泌尿生殖系统肿瘤

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。cirt-ITCH通过抑制Wnt/β-Catenin和PI3K/AKT/mTOR通路来阻碍PCa的发展。

女性生殖系统癌包括卵巢癌(OC)、子宫内膜癌(EC)和宫颈癌是三种最常见的妇科恶性肿瘤。OC中circ-ABCB10的表达显著上调，Circ-ABCB10通过调控Capn4/Wnt/β-catenin在OC进程中发挥关键作用。Circ_0109046和circ_0002577的高表达预示EC患者预后不良。Circ_0109046通过海绵化miR-105来激活Wnt/β-catenin通路，从而增加SOX9的水平。Circ_0002577作为miR-197的海绵，调节EC中的CTNND1/Wnt/β-catenin轴。CircSAMD11/miR503/sox4/Wnt/β-catenin轴在宫颈癌进展中发挥重要作用。

5. 其它

如图3所示，Wnt通路相关环状RNAs在呼吸系统癌症、神经系统癌症、泌尿生殖系统肿瘤、血液系统癌症、肌肉骨骼系统癌症、内分泌系统癌症和其他系统癌症中具有显著性的作用效果。

图3.Wnt相关环状RNAs在多种肿瘤中发挥作用

三. 应用前景和诊断治疗

Wnt相关的环状RNAs与癌症进展密切相关。Wnt相关的环状RNAs可能在癌症诊断、预后和治疗中是非常有前途的生物标志物。Wnt相关的环状RNAs可用于许多癌症的早期诊断。它们在多种系统的肿瘤中异常表达，如消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、神经系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、肌肉骨骼系统肿瘤和内分泌系统肿瘤。

肿瘤治疗发展迅速，但仍然是世界上最具挑战性的问题之一。基于环状RNAs的靶向治疗策略为癌症治疗的发展提供了新的思路。环状RNAs直接或间接地与Wnt通路相互作用来调节许多细胞的生物学功能。然而，寻找能够稳定控制环状RNAs表达并传递这种作用的靶向药物是目前的难点，需要对Wnt相关环状RNAs的结构和功能有更深入的了解。大多数环状RNA充当miRNA的海绵，激活或失活Wnt通路。调控Wnt相关环状RNAs的靶miRNAs也是可行的。MiR-582干预可有效逆转CRC中circ_0009361调控的细胞生物学功能。

研究稳定控制环状RNAs表达并诱导这种作用的靶向药物，需要进一步了解Wnt相关环状RNAs的结构和功能。多数相关实验都是基于组织和细胞研究，理想有效的分子标志物应在血浆、血清和其他体液中稳定表达。Wnt相关的环状RNAs在癌症治疗中是有前景的潜在生物标志物。参与Wnt通路的环状RNAs之间的相互作用及相关机制需要更多的研究证实。

原文链接：https://doi.org/10.1186/s12943-022-01582-0

4月28日，Cell子刊Molecular Therapy: Nucleic Acid杂志在线发表了一项线粒体circRNA的功能研究，报道发现线粒体基因组编码的circRNA mc-COX2在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中高表达，可以促进细胞增殖，促进凋亡抵抗。干扰mc-COX2可协同促进抗肿瘤药物的作用（[1]）。本文首次报道了线粒体来源的circRNA在血液肿瘤中具有促癌作用。文章的通讯作者是南京医科大学附属第一医院李建勇主任和金晖博士。该项研究由李建勇教授团队与吉赛生物合作完成。

环状RNA（circRNA）是一种新型的非编码RNA，它在癌症的发生和进展过程中起着非常重要的作用。目前的研究绝大部分集中在核基因组产生的（nu）-circRNA，对线粒体基因组产生的（mt）-circRNA的生物学作用和临床特征仍然未知。在这项研究中，作者发现并鉴定了一种在慢性淋巴细胞白血病（CLL)患者血浆中高度表达的mt-circRNA ：mc-COX2，来源于CLL细胞并由外泌体递送，其表达水平与CLL的进展和预后相关。

图1 CLL中mc-COX2作用机制 （[1]）

mt-circRNA在CLL患者的血浆和细胞中高表达

circRNA与多种疾病有关，并在肿瘤发生发展中起到重要作用。然而，人们对circRNA在血液疾病尤其是CLL中的功能了解甚少。为了揭示circRNA在CLL中的表达谱，作者收集了5位初诊未治的CLL患者和5位年龄/性别匹配的健康捐助者（HD）的血浆样品，用于circRNA芯片分析。结果显示，在CLL血浆中有51个circRNA表达显著变化（倍数≥2，p <0.05）。令人惊讶的是，在28种上调的circRNA中，排名前4位的circRNA均为mt-circRNA。其中选取hsa_circ_0089762（mc-COX2）进行验证和进一步研究。通过Northern Blot证实了mc-COX2是环状RNA，RNA-FISH结果表明mc-COX2主要分布于细胞质中。

图2 mc-COX2在CLL患者血浆及细胞中检测及鉴定（[1]）

大量的mc-COX2富集在外泌体中并可以作为CLL患者的预后指标

由于CLL血浆中mc-COX2的表达显著增高，作者进一步研究其生物学作用和临床特征。首先，从54例初诊未治的CLL患者和40例HD中收集血浆样本进行qPCR，以评估mc-COX2的临床价值。如预期，与HD相比，CLL患者中mc-COX2的表达明显增加。根据血浆中mc-COX2的表达水平，将CLL患者分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier分析显示，高表达组的CLL患者总生存率（OS）明显较低，提示mc-COX2可以作为CLL患者的预后指标，它的高表达伴随着较差的预后。

有证据表明circRNA可以在外泌体中富集，从而使circRNA进入血液循环并在血浆中检测到。作者推测CLL患者血浆中特异性高表达的mc-COX2可能来源于肿瘤细胞并由外泌体运输。为此，作者收集了20名CLL患者和20名HD的血浆样本并分离出血浆外泌体。然后通过共聚焦电子显微镜对这些囊泡进行观察。通过流式细胞仪和Western blot检测到外泌体标志物CD63、CD81和TSG101的存在，证实了该血浆外泌体的纯度。qRT-PCR的结果表明，与正常对照相比，CLL血浆外泌体富含mc-COX2。这些结果表示mc-COX2在外泌体中含量丰富，外泌体可以把mc-COX2从CLL细胞传递到血浆中。

图3 mc-COX2在血浆外泌体中富集并可以作为CLL患者的预后指标 （[1]）

mc-COX2的特征

使用特异性跨剪接位点的引物进行反转录PCR扩增mc-COX2，产物进行测序，验证了mc-COX2在MEC-1（CLL细胞系）和HEK-293T（人类胚胎肾细胞系）中存在。用RNase R和放线菌素D来验证mc-COX2的稳定性，作者首次发现并证实了mc-COX2的稳定性比ciRS-7（已被报道的一种nu-circRNA）和circRPL15（已被报道的在CLL血浆中高表达的nu-circRNA）低，但比线性RNA稳定得多。

已知RNA结合蛋白（RBP）参与circRNA的生成过程。由于线粒体基因组中存在大量RBP结合位点，探索RBP是否可以调节mt-circRNA的生成。通过circInteractome预测分析出与4个高表达mt-circRNA相关性最高的RBP：AGO1、AGO2和FMRP。在MEC-1中，使用siRNA分别敲低AGO2、AGO1和FMRP，发现mc-COX2表达没有显著变化，该结果提示mt-circRNA的生成或许不受到相关RBP的调控。

由于circRNA被广泛证明具有内源竞争RNA（ceRNA）的功能，因此作者评估了mt-circRNA作为microRNA（miRNA）海绵的潜力。使用AGO2抗体进行IP分析，以检测circRNA与AGO2蛋白的结合能力。与ciRS-7不同，mc-COX2无法被AGO2抗体富集中。因此，作者推测mc-COX2乃至其他mt-circRNA有可能通过不同于nu-circRNA的特殊机制发挥调控作用。

图4 mc-COX2的特征 （[1]）

mc-COX2可以影响线粒体功能并促进CLL细胞增殖

鉴于mc-COX2源自线粒体基因组，作者进一步探索了mc-COX2表达是否可以调节线粒体功能。使用JC-1荧光探针分析线粒体膜电位，发现mc-COX2的敲低降低了RFP / GFP的比例。此外，通过ATP测定法检测mc-COX2对ATP水平的调节，抑制mc-COX2后，ATP的产量显着下降。之后，探索mc-COX2在细胞生长中的作用，通过CCK-8实验和细胞计数检测了CLL细胞系（MEC-1，JVM-3）和CLL患者的原代细胞（CLL-1）的增殖能力，结果显示mc-COX2的敲低明显抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。对CLL患者原代细胞中凋亡细胞的百分比进行了定量，验证了相同的结果。这些结果表明，mc-COX2对CLL细胞的线粒体功能、细胞的增殖和凋亡起到一定的调控作用。

图5 mc-COX2调节线粒体功能和CLL细胞增殖 （[1]）

线粒体相关化合物和抑制剂可以降低mc-COX 2水平与协同mc-COX 2抑制CLL细胞增殖

据报道，与正常的B淋巴细胞相比，CLL细胞的线粒体生成数量增加。为了探索mc-COX2表达是否取决于线粒体的数量和活性，作者使用不同浓度的羰基氰-3-氯苯腙（CCCP）、强力霉素或二甲双胍处理CLL细胞系，观察到mc-COX2在不同时间点显着下调。CCCP可导致线粒体衰竭和细胞凋亡。强力霉素可抑制线粒体活性和细胞生长。二甲双胍是一种有效的线粒体呼吸链抑制剂，可降低不同类型癌症的发生率、进程和死亡率。它们都可以抑制细胞增殖，而敲低mc-COX2可增强这种抑制作用。

图6 线粒体相关化合物对CLL细胞的作用 （[1]）

为了进一步研究线粒体对mc-COX2的影响，作者选择了四种与线粒体相关的小分子抑制剂（Daporinad、PI-103、OSI-027和ABT-199）研究发现，四种抑制剂均可以抑制CLL细胞中mc-COX2的表达和细胞增殖，此外，mc-COX2的敲低会进一步增强四种抑制剂对CLL细胞增殖的抑制作用。其中，OSI-027的抗白血病活性显示出剂量依赖性，低剂量处理即可完全抑制细胞生长，且该抑制剂并未在CLL中有相关研究及报道，作者首次发现了其在CLL中的潜在抗肿瘤作用。这些数据表明线粒体的损伤和数量均影响mc-COX2的生成。更重要的是，在线粒体抑制剂处理后6小时，mc-COX2的减少就已经很明显，这可能与mc-COX2半衰期短有关，也提示mc-COX2的表达与线粒体功能密切相关。此外，mc-COX2的敲低对线粒体相关化合物和抑制剂的抗白血病作用起到协同促进作用。因此，mc-COX2可以作为补充靶标，来增强药物疗效和/或降低药物剂量以提高药物敏感性。

图7 线粒体相关小分子抑制剂对CLL细胞的作用 （[1]）

参考文献

1. Zijuan Wu, Handong Sun, Chunling Wang, Wenjie Liu, Ming Liu, Yanhui Zhu, Wei Xu, Hui Jin, Jianyong Li, Mitochondrial genome-derived circRNA mc-COX2 functions as an oncogene in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy: Nucleic Acid, 2020.

李建勇教授介绍

教授、主任医师、

博士生导师、博士后合作导师

南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）血液科主任

南京医科大学血液研究重点实验室主任

中国抗癌协会血液肿瘤分会名誉主任委员

CSCO中国淋巴瘤联盟副主席

中国医师协会整合血液病学专业委员会副主任委员

中国医药教育协会造血干细胞移植及细胞治疗专业委员会副主任委员

中国慢性淋巴细胞白血病工作组组长

中华医学会血液学分会白血病·淋巴瘤学组 副组长

中华医学会肿瘤学分会淋巴瘤学组  副组长

江苏省医学会血液学分会前任主任委员

江苏省老年医学会血液学分会主任委员

南京医学会血液学分会主任委员

中国免疫学会血液免疫分会常委

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方比较高发的白血病类型，临床主要表现为血液，骨髓，淋巴节或脾脏中单克隆的B细胞增高，常表现为CD5+类型B细胞的增高（[2]）。CLL诊断主要通过血细胞计数，血液涂片，CD5或其他B细胞标志物分子免疫表型进行B细胞克隆群分析（[2]）。免疫球蛋白重链可变区（IGHV）的分析可以作为独立的预后诊断标志，但IGHV分析对检测体系的要求较高，很难在常规检验实验室中推广应用，分析筛选可替代IGHV的标志物分子具有重要的临床应用意义（[1]）。本文作者发现circ-RPL15在CLL中特异性高，是CLL疾病的重要驱动因子，也是潜在的替代IGHV突变分析的CLL标志物分子。下面就让我们一起学习一下本文的主要内容：

CLL中circRNA表达分析

为分析CLL中circRNA的表达特征，作者通过芯片法检测了3例初诊CLL患者和5例健康对照者的血浆circRNA，共分析得到3656个circRNA分子，其中71个circRNA在CLL患者中存在显著差异。进一步用更严苛的分析条件筛选候选circRNA分子，共筛选出6个circRNA分子进行下一步的分析和验证。Sanger测序鉴定和验证了这些分子接口位置的序列，QPCR实验进一步检测了它们在血浆样品中的表达情况，并分析其差异显著性，其中circ-RPL15是差异最显著的。于是本文将研究的目标锁定在这个分子上。

图1 CLL血浆circRNA表达谱分析 （[1]）

CLL中circ-RPL15表达分析

circ-RPL15由RPL15基因的外显子2和外显子3的一部分反向拼接形成。放线菌素D分析稳定性，RNase R消化分析，确定了circ-RPL15的特征，Northern blot实验检测了该分子在CLL细胞系MEC-1和JVM-3中的表达情况。

图2 circ-RPL15鉴定与分析 （[1]，排列有改动）

为进一步分析circ-RPL15在CLL中的表达情况，作者在更大的标本群体中进行了表达分析，共包括137例初诊CLL和50例健康对照，其中随机抽取了30例CLL和20例健康对照者检测了外周血单个核细胞（PBMC）中circ-RPL15的表达。结果表明CLL病人血浆和PBMC中circ-RPL15显著升高，且高表达circ-RPL15预后更差。

图3 CLL中circ-RPL15表达与预后相关性分析 （[1]）

除了CLL，作者还分析了circ-RPL15在不同淋巴组织恶性肿瘤类型中表达情况，结果表明CLL是circ-RPL15表达最高的肿瘤类型。RPL15的mRNA在CLL患者PBMC与健康对照者CD19+细胞之间表达差异不显著，说明circ-RPL15在CLL中是特异性高表达的分子。ROC曲线分析表明circ-RPL15在CLL中AUC值可达0.84，说明circ-RPL15可以作为CLL的标志物分子。现有的CLL分期体系并不能很好的区分患者的疾病进展速度，IGHV检测和FISH检测是最常用的分析CLL患者疾病进展程度的检测指标。上述的结果表明circ-RPL15的表达具有很强的CLL疾病特异性，那么circ-RPL15是否也能用于CLL疾病进程的诊断呢？作者发现IGHV未突变的CLL患者circ-RPL15表达显著高于IGHV突变CLL患者，ROC曲线分析表明circ-RPL15表达是IGHV突变状态的一个可替代的标志物分子（AUC值达0.86）。

图4 circ-RPL15是CLL特异性表达的分子 （[1]）

CLL中circ-RPL15功能与分子机制研究

作者分析了circ-RPL15在CLL细胞中的亚细胞定位和分布情况，结果表明circ-RPL15主要分布于细胞质中。Anti-AGO2 RIP实验结合circBank预测和circInteractome预测分析，作者发现了Circ-RPL15可以竞争性结合miR-643，miR-146b-3p和miR-337-3p。siRNA实验分析后发现，干扰circ-RPL15后只有miR-146b-3p显著增高，说明在CLL中circ-RPL15主要通过miR-146b-3p发挥功能。点突变实验也进一步验证了circ-RPL15与miR-146b-3p的相互作用关系。临床标本的检测结果也表明CLL患者PBMC中circ-RPL15与miR-146b-3p表达趋势相反。

图5 circ-RPL15竞争性结合miR-146b-3p （[1]）

图6 点突变实验证明circ-RPL15竞争性结合miR-146b-3p （[1]）

基于在线分析，作者筛选分析了miR-146b-3p可能的下游作用基因，结合KEGG通路分析，共分析到6个基因可富集到在肿瘤相关通路中。双荧光素报告基因分析表明RAF1对miR-146b-3p的效应最显著。circ-RPL15干扰和miRNA inhibitor实验分析进一步验证了miR-146b-3p对RAF1的调控作用。qPCR也表明CLL患者RAF1表达显著升高。临床标本中RAF1与miR-146b-3p的表达呈现负相关性。Western检测证明高表达circ-RPL15的患者PBMC中RAF1的表达也显著高于circ-RPL15的患者PBMC和健康对照者CD19+细胞。

图7 CLL中RAF1是miR-146b-3p的靶基因 （[1]）

CLL细胞系中进一步验证了circ-RPL15/miR-146b-3p/ RAF1通路的情况，包括RAF1下游ERK，MEK和BAD的磷酸化状态，结果表明干扰circ-RPL15可抑制下游基因的磷酸化并抑制细胞增殖，而miR-146b-3p的inhibitor因子则促进他们的磷酸化并促进细胞增殖。

图8 circ-RPL15/miR-146b-3p/ RAF1通路验证 （[1]）

本文的工作首次在CLL中探索了circRNA的表达和功能机制，初步证明了circ-RPL15在CLL疾病进程和临床诊断中的价值，对CLL疾病相关的研究有重要意义。

李建勇教授介绍

主任医师，教授，博士生导师，博士后合作导师

南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）血液科主任

南京医科大学血液研究重点实验室主任

中国抗癌协会血液肿瘤分会名誉主任委员

CSCO中国淋巴瘤联盟副主席

中国医师协会整合血液病学专业委员会副主任委员

中国医药教育协会造血干细胞移植及细胞治疗专业委员会副主任委员

中国慢性淋巴细胞白血病工作组组长

中华医学会血液学分会白血病·淋巴瘤学组 副组长

中华医学会肿瘤学分会淋巴瘤学组  副组长

江苏省医学会血液学分会前任主任委员

江苏省老年医学会血液学分会主任委员

南京医学会血液学分会主任委员

中国免疫学会血液免疫分会常委

参考文献

1. Zijuan Wu, H.S., Wenjie Liu, Huayuan Zhu, Jianxin Fu, Chuang Yang, Lei Fan, Li Wang, Yanfeng Liu, Wei Xu , Jianyong Li, Hui Jin, Circ-RPL15: a plasma circular RNA as novel oncogenic driver to promote progression of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 2019.

2. Hallek, M., Chronic lymphocytic leukemia: 2017 update on diagnosis, risk stratification, and treatment. Am J Hematol, 2017. 92(9): p. 946-965.

FLT3-ITD是在FLT3基因中间的一段串联重复序列突变，该突变可导致Y591的自磷酸化，进而激发下游通路的过度激活，最终促进白血病的进程。FLT3-ITD突变型的AML病人预后较差且容易复发。FLT3的抑制剂可缓解这类白血病患者病情，但往往会因为FLT3基因的二次突变而导致耐药。因此，依然需要开发FLT3突变AML疾病新的治疗靶点。本文基于GEO数据分析，筛选到来自MYBL2基因的一个circRNA分子（circMYBL2），circMYBL2可以特异性的在FLT3-ITD阳性的AML细胞系中促进细胞增殖。机制方面，circMYBL2可通过结合PTBP1促进FLT3蛋白的翻译效率，进而促进疾病进程。有趣的是，作者的结果表明干扰circMYBL2对于FLT3抑制剂耐药的细胞也是有效的，说明circMYBL2是一个潜在的FLT3-ITD AML的治疗靶点。下面就让我们一起学习一下这篇文章：

如何发现circMYBL2的？

作者通过GEO数据分析了FLT3-ITD阳性和阴性的AML病人数据，发现了373种差异表达的circRNA分子，其中有28种分子的来源基因是已报道的与AML疾病发生发展有关的，其中便包括circMYBL2。circMYBL2来源于MYBL2基因的8-9外显子，QPCR表明circMYBL2在FLT3-ITD阳性病人中表达量显著高于阴性的患者，大约高出5倍左右。circMYBL2主要定位于胞浆，可耐受RNase R消化。

图1 circMYBL2在FLT3-ITD阳性AML中高表达 （[1]）

敲降circMYBL2可特异性的抑制FLT3-ITD阳性AML细胞的增殖并可克服quizartinib耐药性

为分析circMYBL2在FLT3-ITD阳性和阴性细胞中的功能，作者设计了siRNA进行分析。所设计的siRNA仅能对circMYBL2起敲降作用，但对起来源基因MYBL2没有影响。circMYBL2敲降后对FLT3-ITD阳性的MOLM-13细胞和MV4-11细胞具有显著的抑制增殖功能，也可以促进其凋亡。但在FLT3-ITD阴性的THP-1，ML-2和HL60细胞中效应不明显。敲降circMYBL2也可显著抑制FLT3-ITD阳性患者AML细胞克隆形成，但对FLT3-ITD阴性的AML患者细胞克隆形成没有明显影响。说明circMYBL2仅在在FLT3-ITD阳性AML中特异性发挥作用。

图2 circMYBL2特异性在FLT3-ITD阳性AML中起作用（[1]）

circMYBL2可特异性的在FLT3-ITD阳性AML细胞中促进增殖，那么在FLT3抑制剂耐药的细胞中该分子有没有可能成为治疗的靶点呢？作者通过诱导构建quizartinib耐药的细胞株（MOLM-13-RQ），然后分析敲降circMYBL2是否有效。结果表明在MOLM-13-RQ中敲降circMYBL2也可以与非耐药的MOLM-13细胞有相似的作用效果，说明敲降circMYBL2可以作为克服quizartinib耐药的治疗手段。

图3 敲降circMYBL2可克服quizartinib耐药 （[1]）

circMYBL2调控FLT3的蛋白翻译

为分析circMYBL2是否与FLT3通路有关，作者分析了敲降circMYBL2后FLT3的总蛋白和磷酸化的状态，发现干扰circMYBL2后FLT3的总蛋白量呈现下降趋势，在FLT3-ITD阳性的病人细胞中也有相似的现象。但QPCR结果显示干扰circMYBL2并不影响FLT3的mRNA量，说明circMYBL2可能与FLT3的蛋白总量的调控有关。下游通路中STAT5的磷酸化状态，c-Myc的表达量也会伴随着干扰circMYBL2而下降。在一例FLT3-D835Y突变的病人中，干扰circMYBL2也可以下调FLT3的表达量，但不影响FLT3的mRNA水平。quizartinib耐药的MOLM-13-RQ中也有类似的现象。放线菌酮（CHX）处理后收取不同时间点的总蛋白可以分析蛋白的降解速率，作者发现干扰circMYBL2并不影响FLT3蛋白的半衰期，说明circMYBL2并不是通过影响FLT3蛋白的降解途径调控其蛋白量的。蔗糖密度梯度离心分离核糖体组分的结果表明，干扰circMYBL2后显著降低FLT3的mRNA中结合多个核糖体（polysome）的比例，说明干扰circMYBL2后可影响FLT3的mRNA翻译效率。

图4 circMYBL2调控FLT3的翻译 （[1]）

circMYBL2与PTBP1相互作用

作者首先基于AGO2的CLIP数据分析，没有找到circMYBL2与AGO2相互做的证据，抗AGO2抗体的RIP实验也没有捕获circMYBL2，因此排除了circMYBL2作为miRNA竞争性结合分子的可能。为探索circMYBL2如何调控FLT3的翻译的，作者构建了circMYBL2拉直的过表达载体，在其一端添加了SA apatamer，通过SA Beads拉相互作用的蛋白，然后质谱分析。在这一体系中拉到的相互作用蛋白进行GO通路分析。作者共得到203种相互作用蛋白，其中有13种蛋白与蛋白翻译调控有关。其中PTBP1与circMYBL2的相互作用较强，进一步的WB验证也确认了circMYBL2与PTBP1的相互作用。不同的抗体进行RIP实验，也证明PTBP1是与circMYBL2和MYBL2 mRNA相互作用最强的分子。与干扰circMYBL2相似，干扰PTBP1也可以显著降低FLT3的蛋白水平和STAT5的磷酸化水平。

图5 circMYBL2与PTBP1相互作用 （[1]）

MV4-11和HL60细胞中过表达circMYBL2或PTBP1均可增加FLT3的蛋白表达水平。MV4-11细胞中干扰PTBP1可降低FLT3结合多个核糖体的比例，说明PTBP1参与FLT3的蛋白翻译调控作用。293T细胞中分别过表达circMYBL2，PTBP1或两者一起共表达均可显著促进FLT3蛋白的丰度。抗PTBP1的抗体可同时捕获circMYBL2和MYBL2 mRNA，过表达circMYBL2可促进PTBP1的抗体捕获MYBL2 mRNA的效率。说明circMYBL2可促进PTBP1与MYBL2 的mRNA的结合效率。

图6 circMYBL2促进PTBP1与MYBL2 mRNA的结合 （[1]）

敲降circMYBL2抑制FLT3-ITD AML肿瘤发生和浸润

NOD-SCID小鼠分别通过尾静脉注射不同shRNA载体稳定感染的MOLM-13细胞，包括sh-NC和sh-circMYBL2。三周后分析骨髓和淋巴结转移的情况。sh-circMYBL2组淋巴结中转移的细胞显著低于sh-NC组。组织中，骨髓，脾脏和肝脏中转移的细胞数也远少于sh-NC组。sh-circMYBL2组CD11b和CD14显著增加，说明干扰circMYBL2有助于细胞分化。sh-circMYBL2组生存时间远高于对照组。

图7 体内实验 （[1]）

本文的研究思路总体与其他circRNA的研究比较相似，但作者发现的circMYBL2 可以通过结合PTBP1促进FLT3的蛋白翻译机制对于FLT3-ITD阳性AML的致病机制有新的贡献，尤其是干扰circMYBL2仅显示出在FLT3-ITD 阳性AML中有作用，并且可以克服FLT3抑制剂（quizartinib）耐药性，这个对于FLT3突变尤其是使用quizartinib后二次突变复发的AML患者的治疗有重大意义。本文的工作也再次向我们展示了circRNA在生物医学领域的重要意义和价值，值得各位同仁借鉴。

参考文献：

1. Sun, Y.M., et al., CircMYBL2, a circRNA from MYBL2, Regulates FLT3 Translation by Recruiting PTBP1 to Promote FLT3-ITD AML Progression. Blood, 2019.

今天给大家分享的是一篇刚刚发表在Aging-US杂志的文章（IF=5.179），通讯作者是南京医科大学附属第一医院的李建勇教授和金晖博士。这篇文章最大的特点是首先从miR-337-3p入手，验证其在CLL病人中的功能，然后基于预测分析+验证的方式找出在CLL中miR-337-3p作用的上下游基因，包括mRNA和circRNA，其中靶向的circRNA分子是通过circBank数据库进行的预测分析。目前绝大部分circRNA作为miRNA Sponge模型的研究几乎千篇一律的按照筛选circRNA然后找下游miRNA分子的“套路”进行，这篇文章的思路和做法则像是一股清流，给读者带来耳目一新的感觉，值得同行学习。

miR-337-3p在CLL细胞系和病人中高表达，促进增殖，抑制凋亡

与以往报道关于miR-337-3p在多种实体瘤中起到抑癌作用不同，作者前期研究发现miR-337-3p在慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中呈现高表达趋势，于是作者在CLL病人标本和细胞系中分别验证了miR-337-3p的表达情况，证明miR-337-3p的确在CLL中显著上调。功能研究表明miR-337-3p可以促进CLL细胞增殖，抑制凋亡。

图1 CLL中miR-337-3p表达与功能研究 (Wei Wu 2019)

PML是miR-337-3p在CLL中的下游靶基因

为找出miR-337-3p的下游作用靶基因，作者利用在线工具进行分析，然后取交集，作为最有可能的靶基因分子进行下一步的验证。这里作者用到的的在线工具包括：

Targetscan：http://www.targetscan.org/vert_71/

miRDB：http://mirdb.org/

Pictar：https://pictar.mdc-berlin.de/

三种工具分析结果的靶基因交集为：WDR26，PML和PAPOLB。进一步基于过表达miR-337-3p后分析对应mRNA丰度变化及靶基因WB检测，双荧光素酶报告基因实验，共表达和相关性分析等进一步确认了PML是miR-337-3p在CLL中的下游靶基因。

图2 CLL中miR-337-3p的下游靶基因分析 (Wei Wu 2019)

circBank助力找出miR-337-3p的靶分子

circBank数据库提供了基于miRNA检索靶分子circRNA的工具，作者通过设置较为严格的筛选条件（图3A，推荐miRNA研究方向的同行使用），使用该工具成功检索到三个miR-337-3p的下上游靶circRNA分子：hsa_circ_0004731，hsa_circ_0132266和hsa_circ_0029937。qRT-PCR验证CLL病人与健康对照组表达情况，初步证实hsa_circ_0132266（circBank ID：hsa_circMTO1_002）是miR-337-3p上游靶circRNA分子。后续利用特异性引物的设计以及放线菌素D等实验证实了hsa_circ_0132266的环状RNA特征。

图3 CLL中miR-337-3p作用靶circRNA分子分析 (Wei Wu 2019)

miR-337-3p与circ_0132266的相互作用分析

利用核质分离实验、RNA-FISH共定位以及RIP实验证实了circ_0132266作为ceRNA的潜力；通过双荧光素酶报告基因实验证实了miR-337-3p与circ_0132266的相互作用。

图4 miR-337-3p与circ_0132266的相互作用验证 (Wei Wu 2019)

研究者分别构建circ_0132266的siRNA，miR-337-3p的mimic /inhibitor，通过回复实验分析了细胞表型以及PML蛋白的表达情况，结果表明circ_0132266可以通过竞争性结合miR-337-3p促进其对下游基因PML的表达。

图5 circ_0132266竞争性结合miR-337-3p促进PML表达 (Wei Wu 2019)

最后，本文的发现可概括为下图：circ_0132266可以通过竞争性结合miR-337-3p，从而促进下游靶基因PML的表达。但在CLL病人中，circ_0132266下调，释放了miR-337-3p，进一步抑制了PML蛋白的表达水平，促进细胞增殖，降低凋亡。

图6 circ_0132266作用通路模式图 (Wei Wu 2019)

李建勇教授介绍：

主任医师，教授，博士生导师，博士后合作导师

南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）血液科主任

南京医科大学血液研究重点实验室主任

中国抗癌协会血液肿瘤分会名誉主任委员

CSCO中国淋巴瘤联盟副主席

中国医师协会整合血液病学专业委员会副主任委员

中国医药教育协会造血干细胞移植及细胞治疗专业委员会副主任委员

中国慢性淋巴细胞白血病工作组组长

中华医学会血液学分会白血病·淋巴瘤学组 副组长

中华医学会肿瘤学分会淋巴瘤学组  副组长

江苏省医学会血液学分会前任主任委员

江苏省老年医学会血液学分会主任委员

南京医学会血液学分会主任委员

中国免疫学会血液免疫分会常委

参考文献

Wei Wu, Z. W., Yi Xia, Shuchao Qin, Yue Li, Jiazhu Wu, Jinhua Liang, Li Wang, Huayuan Zhu, Lei Fan, Jianxin Fu, Wei Xu, Hui Jin, Jianyong Li (2019). “Downregulation of circ_0132266 in chronic lymphocytic leukemia promoted cell viability through miR-337-3p/PML axis.” Aging.

波形蛋白（VIM）是 III型中间丝的主要成分。波形蛋白是由VIM基因编码的，并且普遍表达在内皮细胞和其他间充质细胞。 VIM在许多重要的生理和病理过程发挥作用，如粘连，迁移，细胞信号传导，炎症，神经突延伸和血管形成。 在包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胃肠癌、中枢神经系统癌症、恶性黑色素瘤和造血恶性肿瘤等不同上皮肿瘤中发现了表达水平增加的VIM，可能与肿瘤生长，侵袭和预后不良有关。 Circ-VIM，是由VIM基因产生的circRNA，在这些癌症中很少被研究过，更不用说Circ-VIM 在AML中的相关研究了。 这项研究的目的是调查和分析Circ-VIM在AML患者中的表达情况及探讨其临床相关性和与基因VIM的相关性。

来自江苏大学附属人民医院的邓兆群教授团队于J Cell Physiol在线发表题为“Circular RNA of vimentin expression as a valuable predictor for acute myeloid leukemia development and prognosis”的临床研究，揭示了Circ-VIM的水平与AML病人的WBC数目、更低OS和LFS成正相关，Circ-VIM可作为急性髓系白血病发展程度和预后的理想生物标志物。

1. 相比于42名正常健康人，全组112名AML病人的骨髓单核细胞BMNCs的Circ-VIM平均表达水平明显增高，特别是在患有非急性早幼粒细胞白血病（Non-APL）和细胞遗传学正常的CN-AML患者中。

1. ROC曲线分析说明Circ-VIM表达水平可用于从健康人群中区分出全组AML病人，而且也可以很明显地区分出Non-APL和CN-AML患者，提示Circ-VIM可作为诊断AML的理想生物标志物。

1. 根据Circ-VIM的表达水平，将113 AML病人分为Circ‐VIM^high组和Circ‐VIM^low组，发现两组的性别、年龄、血红蛋白、血小板、骨髓母细胞、核型分类和九种基因突变方面无明显差异，但是两组间的全白细胞计数和FAB亚型分类有明显差异。Kaplan–Meier分析，发现Circ‐VIM^high组的AML病人的OS和LFS指标更低（a,d）。同样地，在Non-APL和CN-AML病人中，也发现Circ‐VIM表达水平越高，患者的OS和LFS越低(b, c,e, f)。

1. 经过多变量分析和单变量分析，发现在所有AML病人中Circ‐VIM是一个独立的预后因素。但是对于CN‐AML 和non‐APL AML病人，Circ‐VIM表达水平对患者的OS和LFS影响无明显差异。

1. PCA分析发现，AML病人中的Circ‐VIM表达水平与全白细胞计数、母系基因VIM的表达水平成正相关。而且相比健康人群，AML病人中的基因VIM表达水平也是明显升高的。

总结：该研究发现AML病人，特别是CN‐AML 和non‐APL AML病人中，Circ‐VIM表达水平和VIM基因的表达水平明显增加，其与病人的低OS和LFS成正相关，也可以用于区分健康人群和AML病人，提示其有作为诊断AML的生物标志物的潜能。但是该研究采用的样本数目偏少，无法真正明确Circ‐VIM表达水平与除了WBC和FAB分型的其他临床表现和实验室特征的联系，另外Circ‐VIM从来没有被报道与任何人类肿瘤发生发展有关，对作者设计证明Circ‐VIM促进肿瘤发展的体内和体外实验有一定的限制。VIM基因在EMT进程中发挥重要的作用，而EMT与某些肿瘤的发生发展密切相关，所以对于VIM基因产生的Circ‐VIM对肿瘤的影响的研究值得进一步的深入探究，探究其影响肿瘤发展的具体分子机制。

参考文献

1. Yi YY, et al. Circular RNA of vimentin expression as a valuable predictor for acute myeloid leukemia development and prognosis. J Cell Physiol. 2018 Aug 28. doi: 10.1002/jcp.27145.