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circRNA创新疗法的突破与展望

admin — Thu, 06 Feb 2025 09:02:59 +0000

近年来，circRNA高质量研究热度攀升。作为下一代RNA药物开发的理想平台，聚焦于circRNA的早筛早诊、预后评估、新型疗法、体外合成工艺及包封递送技术等研究，为circRNA从实验室迈向临床提供了有力支撑。

2024年，中国药企率先发力，推动两款国际领先的circRNA药物实现里程碑式的突破。转录本生物（RiboX）用于治疗放射性口干症的RXRG001疗法；环码生物（CirCode）用于治疗缺血性心脏病的HM2002注射液。先后获得美国FDA和中国NMPA的临床试验许可（IND），circRNA疗法取得跨越式进展。

本文将回顾2024年，circRNA从基础研究到临床转化的进展：

基础研究

新型靶点的挖掘展示精准医疗潜力
生成和转运机制研究提供精准干预策略
编码or非编码生物学功能启发新型疗法
数据信息及分析工具加速研究进程

转化应用

生物标志物研究有望实现早筛早诊及预后评估
疫苗/肿瘤免疫/基因编辑等疗法研究成果丰硕
提升合成工艺及递送策略加速成药进程

临床进展

中国两款circRNA药物进入IND阶段
全球管线推进产业升级以加速临床转化

展望

circRNA潜力无限且未来可期

基础研究

一 新来源的circRNA

1976年，circRNA分子首次在植物类病毒基因组中被发现，沉寂30余年后，研究者通过高通量测序技术发现其在人体内广泛存在且与生命活动密切相关，circRNA迅速成为备受瞩目的明星分子。自然界中circRNA的种类和复杂性远超人们想象，大量特性和功能仍待探索。2024年，一些新来源的circRNA涌现，为精准医疗靶点挖掘带来新希望。

斯坦福大学Andrew Z Fire团队在人类口腔和肠道微生物组数据中，新发现一类circRNA，命名为“Obelisk（方尖碑）”。Obelisk是介于病毒与类病毒之间的全新元件，可能会改变细菌宿主的基因活动，进而影响人类基因。^[1]

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华中科技大学协和深圳医院肖礼祖联合美国罗格斯大学朱桦和霍华德大学唐七义，采用二代和三代ONT测序在水痘带状疱疹病毒（VZV）及其感染的神经母细胞瘤中，鉴定了一种源自VZV潜伏期相关转录本(VLT)的VZV circRNA（circVLTSlytic）。circVLTSlytic在VZV发病机制中发挥重要作用，可以增强VZV对阿昔洛韦的耐药性，使VZV逃避抗病毒治疗，具有作为优化治疗的靶点和作为药效标志物的潜力。^[2]

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二 circRNA的生成及转运

circRNA生成

circRNA主要通过反向剪接生成，其过程受多种顺式元件和反式因子调控，这一独特生成过程的精准调控为疾病诊断和治疗提供了新思路。

中国科学技术大学王小林/单革团队发现ZC3H14蛋白可以通过结合成环序列外显子-内含子边界和3’UTR，促进circRNA产生，在雄性生殖中发挥关键作用。深入研究睾丸中circRNA生成机制和功能，有望为不育症的临床治疗提供新的有效治疗策略。^[3]

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中南大学朱曲波团队为了增强体内circRNA的生成，利用称为“circRNA促进RNA（cpRNA）”的工具，可以通过补充pre-mRNA中反向互补匹配(RCMs)的侧翼序列，优化外显子环化，从而促进circRNA的形成。cpRNA作为一种极具潜力的circRNA过表达策略，为circRNA表达水平低下引发的疾病提供了有前景的治疗思路。^[4]

circRNA转运

circRNA主要在细胞核内生成，大部分转运至细胞质中发挥作用。其出核过程受多种生物学机制调控，动态转运亦影响其功能。circRNA转运机制的揭示为干预circRNA功能的治疗策略提供理论基础。

墨尔本大学Vihandha Wickramasinghe联合阿德莱德大学Gregory Goodall团队发现小分子GTP酶Ran-GTP的梯度，出核受体exportin-2，以及IGF2BP1/2都可调控circRNA的出核。这些分子机制为干预circRNA转运开发疾病疗法提供了可能性。^[5]

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随后，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲团队首次发现将circRNA出核调控与功能作用关联。一类腺苷酸富集的circRNA在人源胚胎干细胞H9的细胞核中滞留，并随着定向分化为前脑神经元的过程中出核，其动态定位参与调控蛋白质翻译和神经元的突触生长。^[6]

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三 circRNA的生物学功能

随着技术工具的发展，circRNA更多功能被解锁，作用机制也逐步清晰。功能机制研究为基于circRNA的疾病早期诊断、治疗监测和新型疗法的研发提供了理论支撑和全新思路。

图1 circRNA的生物发生及功能^[7]

circRNA翻译

circRNA的可翻译性及其翻译产物的功能是近年的研究热点，其可翻译性是其替代线性mRNA成为下一代RNA疗法的前提。circRNA可由内部核糖体进入位点（IRES）、m⁶A修饰或外显子连接复合物（EJC）等介导翻译起始。

● 翻译机制研究，优化circRNA药物设计

中科院上海生命科学研究院王泽峰团队基于机器学习算法，预测到大量具有翻译激活子活性的潜在RBP，这些激活因子可促进IRES介导的circRNA翻译。特定的翻译激活因子可调控IRES介导的circRNA在不同细胞环境下的翻译。通过设计在特定细胞中启动翻译的IRES，可得到细胞特异性翻译的circRNA，从而达到精准治疗的目的。^[8]

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缺乏终止密码子的circRNA允许核糖体沿circRNA翻译多次，从而产生多聚蛋白，这一过程称为滚动环翻译（RCT）。多聚蛋白可被蛋白酶或自切割序列，在单轮起始中产生多个GOI拷贝。RCT的效率可以是单次翻译的100倍。英国MRC分子生物学实验室Venki Ramakrishnan（2009年诺贝尔化学奖得主）团队设计RCT的circRNA构建，与单次翻译相比，可使蛋白表达高出7,000倍以上。^[9]

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● 挖掘潜在编码circRNA，提供治疗诊断靶点

重庆医科大学肖斌团队发现在肾透明细胞癌（ccRCC）中高表达的circPDHK1，可通过编码新蛋白PDHK1-241aa，促进ccRCC的生长和转移。抑制ccRCC细胞中circPDHK1的表达，可以提高细胞对TKIs药物的敏感性。PDHK1-241aa可作为治疗ccRCC的药物研发的潜在新靶点。^[10]

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circRNA与mRNA互作

韩国科学技术院Yoon Ki Kim研究团队揭示了circRNA可通过与mRNA的3′ UTR相互作用，将其携带的外显子连接复合体（EJC）定位在mRNA的3′ UTR附近，从而靶向调控无义介导的mRNA降解(NMD)机制。人工设计的circRNA，可靶向下调mRNA水平，为circRNA在基因沉默和疾病治疗中的潜在应用开辟了广阔前景。^[11]
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circRNA结合蛋白

circRNA在体内可作为分子海绵招募蛋白，该功能也是人工设计circRNA适配体的大前提。

circRNA可调控染色质的RNA结合蛋白的功能。重庆大学黄川团队发现一类富含金属响应元件的circRNA，可作为trans-acting因子，在铜胁迫过程中与ChRBP gawky特异性结合，调控多种应激胁迫基因转录，并清除受损细胞。^[12]

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江苏省人民医院、南京医科大学第一附属医院李相成/李长贤团队发现circPCNXL2通过与STRAP相互作用激活ERK信号通路，调节miR-766-3p/SRSF1轴，促进肝内胆管癌（ICC）生长和转移。circPCNXL2可作为ICC诊断和预后生物标志物，也是一个很有前景的ICC治疗靶点。^[13]

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circRNA也可作为支架调节蛋白与蛋白之间的相互作用。复旦大学附属肿瘤医院唐爽/宋少莉团队发现缺氧诱导的外泌体中的circPLEKHM1可以促进PABPC1-eIF4G的相互作用，从而促使巨噬细胞M2极化，加速癌症的转移过程。circPLEKHM1靶向治疗可以显著抑制体内非小细胞肺癌（NSCLC）的转移。外泌体circPLEKHM1可作为潜在的肺癌转移预后生物标志物和治疗靶点。^[14]

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miRNA sponge

作为miRNA sponge的circRNA，可通过竞争性结合miRNA，间接调控mRNA的稳定性。南方医科大学南方医院谭万龙团队揭示了膀胱癌来源的外泌体circRNA_0013936，作为miR-320a和miR-301b的分子海绵，上调FATP2的表达，下调RIPK3的表达，从而促进抑制性免疫。circRNA_0013936有望成为膀胱癌的有效治疗靶点。^[15]

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四 circRNA数据库

通过优化算法、整合多组学数据以及推动分析技术的创新，可以提升识别和解析circRNA的效率和准确性，为精准医疗和药物研发提供坚实的技术支撑。

TCCIA：由遵义医科大学第二附属医院马虎团队开发的综合性的肿瘤免疫治疗circRNA数据库^[16]

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circBank 2.0：由吉赛生物刘明团队开发升级的circRNA信息的综合性数据库，涵盖circRNA保守性、注释、表达信息、miRNA结合位点、验证信息、可视化图、搜索功能、在线分析软件等^[17]

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CICADA：由山东省第一医科大学孙亮团队开发，用于预测circRNA的可翻译性与翻译产物^[18]

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转化应用

一 circRNA临床检测

针对circRNA生物标志物进行分析，有望实现无创或微创的疾病早筛、早诊及预后评估。circRNA定量检测技术的发展，加速了circRNA作为生物标志物应用于临床检验。

美国Circular Genomics公司公布的首个基于大脑富集circRNA血液生物标志物检测方法，具有预测患者对舍曲林反应，以及SSRI类抗抑郁药物总体反应的能力，有望用于指导准确的个性化治疗。

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福建师范大学冯尚源/林多团队联合福建医科大学附属肿瘤医院许元基团队基于表面增强拉曼光谱联合催化发夹组装技术开发的光学纳米生物传感器，能高效检测血液样本中与肺癌相关的circRNA，为早期肺癌的筛查和治疗提供了新的方法。^[19]

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中山大学王佳思团队基于多分散液滴数字CRISPR/Cas13a技术开发的自动化便携式仪器，可通过CRISPR/Cas13a特异性结合circRNA的连接位点区域（BSJ）序列，结合液滴的限域效应实现目标circRNA的现场、自动化、精准定量分析，有望应用于癌症等重大疾病早期诊断。^[20]

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二 circRNA创新疗法

circRNA因其固有稳定性使半衰期较线性RNA更长，有望成为持续干预治疗的理想药物。同时，circRNA免疫原性较低，有利于保障疗效与安全性。围绕circRNA的创新疗法开发，正引领核酸药物迈向新的革命浪潮。

图2 工程化circRNA用于蛋白表达。^[21]

图3 工程化circRNA的非编码功能应用。^[21]

传染病疫苗

circRNA在血液中同样具有较高的稳定性，作为传染病疫苗可提供强大的保护。鉴于mRNA疫苗的成功经验，传染病疫苗将是circRNA的重要的应用方向。

中国科学院广州生物医药与健康研究院冯立强/巫林平/陈凌团队开发的单剂量编码寨卡病毒两种抗原的circRNA疫苗，即可在小鼠体内提供针对寨卡病毒的有效和持久的保护作用，而不会诱导明显的登革热抗体依赖性增强效应。^[22]

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中国科学院武汉病毒研究所龚睿/揣侠团队、环码生物王泽峰团队联合中国科学技术大学Sandra Chiu团队开发的混合多种编码猴痘病毒不同抗原的circRNA，可触发针对猴痘病毒的全面、有效保护。^[23]

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与线性mRNA相比，较少剂量的自我扩增mRNA（SAM）疫苗即可在较长时间内产生所需数量的抗原。然而，SAM RNA存在序列较长、可能引入突变、免疫原性较高、作用机制不稳定等问题。印度生物技术部转化健康科学与技术研究所Milan Surjit团队揭示了相比SAM，circRNA疫苗更安全地表达SARS-CoV-2-RBD抗原，并提供针对SARS-CoV-2更有效的保护。^[24]

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华中农业大学赵凌团队开发整合编码相应抗原和佐剂趋化因子配体CXCL13的circRNA疫苗，可以增强针对流感病毒、SARS-CoV-2的交叉反应抗体提供更广泛的保护，还可针对狂犬病毒提供全面的保护。^[25]

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中山大学公共卫生学院（深圳）陈耀庆/舒跃龙团队联合湖南大学郑克威团队，利用circRNA编码含有N1、N2和乙型流感病毒NA抗原的circRNA疫苗，可以引发针对异源流感的广谱NA免疫，对开发广谱流感疫苗，并控制流感和防范潜在的大流行至关重要。^[26]

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肿瘤疫苗

肿瘤疫苗类型包括肽/蛋白、树突状细胞(DC)和核酸(包括DNA和RNA疫苗)。其中RNA疫苗可在细胞质内快速表达抗原，从而导致强大的免疫激活，还可避免基因组整合和T细胞耐受性相关风险。加之circRNA的独特优势，可成为极具前景的肿瘤疫苗载体。

斯坦福大学的张元豪和Wender研究团队利用circRNA编码卵清蛋白 (OVA)^[27]，多伦多大学李博文团队利用circRNA编码IL-12^[28]、福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙/赵必星团队利用circRNA编码新抗原PTPN2多肽片段^[29]，结果发现这些circRNA肿瘤疫苗均可在模型体内诱导强烈的抗肿瘤免疫反应，且能强效、安全、稳定抑制肿瘤生长，甚至清除肿瘤，效果显著优于线性mRNA，且无明显副作用。

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中山大学附属第一医院张弩团队联合吉赛生物团队开发表达lncRNA编码肽肿瘤抗原的疫苗circH19-vac，可触发针对胶质母细胞瘤的强效细胞毒性T细胞反应并抑制肿瘤生长。^[30]

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circRNA还有望成为优越的肿瘤抗原载体，开发有效的DC疫苗。吉林大学张海红团队开发编码肿瘤抗原FAPα和survivin的circRNA DC疫苗，可显著抑制肿瘤生长，与吉西他滨药物进行联合治疗，显著延长了胰腺癌小鼠的存活率。^[31]

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图4 circRNA疫苗激活免疫反应。^[32]

CAR-T疗法

基于circRNA的CAR-T疗法可避免传统技术的病毒载体、基因组整合和永久转基因表达所带来的风险。复旦大学章旭耀联合美国宾夕法尼亚大学华先欣研究团队表明利用circRNA编码anti-CD19 CAR具有比mRNA更优越的抗肿瘤功效。^[33]

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circRNA还为体内CAR-T疗法提供了优秀的平台，复旦大学璩良团队利用免疫细胞趋向性的LNP体内递送编码anti-HER2 CAR蛋白的circRNA，可显著抑制肿瘤生长，并诱导促炎症肿瘤微环境，联合肿瘤疫苗还可协同增强抗肿瘤活性。^[34]此外，环码生物杨赟联合北京大学邓觅/苗蕾团队，利用编码anti-uPAR CAR蛋白circRNA，可在单核/巨噬细胞和衰老成纤维细胞中有效表达，具有治疗肝纤维化和类风湿性关节炎等炎症性衰老的潜力。^[35]

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蛋白替代疗法

circRNA可长效稳定表达蛋白，可突破蛋白疗法不稳定或容易导致不耐受的限制。科锐迈德孙振华、普瑞康生物曹辉联合东南大学-莫纳什大学联合研究院佟振博团队向间充质干细胞转染编码FGF18蛋白的circRNA，可在大鼠骨关节炎模型中显著促进了软骨修复。^[36]

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东南大学李新松团队联合东南大学附属中大医院郭宗科团队开发的单剂U-LNP/VEGF-A circRNA制剂即可原位长效表达和释放VEGF-A，第12天即可使小鼠糖尿病创面几乎完全愈合，效果显著优于线性VEGF-A mRNA和rhVEGF。^[37]

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此外，中山大学中山眼科中心谢志团队利用circRNA编码NGF，可显著提高视网膜神经节细胞的存活率，效果远优于重组NGF蛋白治疗，为治疗青光眼等视网膜神经退行性疾病提供了新的希望。^[38]

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干细胞疗法

美国加州大学Prashant Mali团队将编码分化调控因子的circRNA转染至多能干细胞，可精准调控其分化方向，为干细胞工程的应用与发展开辟了全新的道路。^[39]

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基因编辑

基因编辑疗法可以通过纠正致病突变，治疗遗传病。RNA介质的短效编辑器为瞬时表达，可避免由基因编辑器持续作用所带来的脱靶效应的累积，保证了疗法的安全性；circRNA相比线性RNA稳定性更高，免疫原性更低，保证了基因编辑疗法的有效性。利用circRNA编码CRISPR/Cas或锌指蛋白等编辑蛋白，或设计环状引导RNA，共同为基因编辑疗法提供了新策略。

● circRNA编码编辑蛋白

美国加州大学Prashant Mali团队利用circRNA编码DNA甲基转移酶DNMT3A-3L和ZF-KRAB融合蛋白，可有效抑制与心血管疾病风险有关的PCSK9的表达。利用circRNA编码CRISPRoff系统的核酸酶失活Cas9（dCas9）、KRAB、DNMT3A-3L融合蛋白通过表观组编辑，可在sgRNA的引导下特异性抑制B2M基因。^[39]

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此外，中国台湾国家卫生研究院余佳益团队利用circRNA编码修饰的Cas13以靶向ER (erCas13)，在sgRNA的引导下，可显著降低黄病毒感染水平。^[40]

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● 引导编辑器

中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队在circRNA中串联置入靶向多个位点的多个crRNA，以及靶向多个位点的RTT-PBS序列，可引导基于Cas12a开发的引导编辑器系统在人类细胞系中同时编辑多达四个基因。^[41]

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另外，德国美因茨分子生物研究所Edward A. Lemke团队利用环状gRNA引导的假尿嘧啶合成酶dyskerin（DKC1）构建人工膜样细胞器，可以显著增强mRNA假尿嘧啶修饰，并通过Ψ修饰靶向抑制终止密码子，可用于治疗遗传性果糖不耐受等过早终止密码子疾病。^[42]

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适配体

适配体是细胞中表达的短结构DNA或RNA，用于结合特定靶标并操纵细胞内过程。circRNA具有高稳定性、特殊折叠和低免疫原性，且内源性circRNA也可与特定蛋白相互作用，因而circRNA具备改造为新型RNA适配体的潜在生物医学应用前景。

陈玲玲团队利用腺相关病毒（AAV）将具有短双链结构的circRNA（ds-cRNA）适配体递送到神经元和小胶质细胞中，能够安全且有效抑制过度激活的蛋白激酶R（PKR），实现对阿尔茨海默病小鼠的神经保护、增强其空间学习和记忆能力。^[43]

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类似地，陈玲玲团队利用靶向脾脏的LNP递送ds-cRNA适配体，可实现PKR异常激活相关的炎性疾病小鼠模型银屑病的干预治疗。^[44]

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发挥内源性circRNA功能

针对功能性内源性circRNA治疗靶点，通过干预内源性circRNA的表达，可以开发更多创新疗法。

中国人民解放军总医院付小兵/张翠萍联合中山大学附属第七医院李海红团队发现含高丰度内源性circCDK13可通过形成circCDK13-IGF2BP3-mRNA复合物，稳定并上调CD44和c-MYC的表达。设计高丰度circCDK13的工程化EV，能促进糖尿病小鼠模型的伤口愈合。^[45]

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江苏省肿瘤医院许林/董高超/蒋峰团队发现肺腺癌中cEMSY可作为免疫原性细胞死亡诱导剂，瘤内给药cEMSY-LNP使LUAD细胞对anti-PD-1治疗增敏，提高肺腺癌的免疫治疗效果。^[46]

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三 circRNA制备工艺及递送策略

工程化circRNA的大规模制备、纯化及高效递送是其临床转化的关键瓶颈。2024年，众多研究团队针对这些关键难题提出解决方案，优化合成工艺，攻克成药难题，为circRNA的临床应用扫清障碍。

circRNA环化策略

目前已经开发了多种circRNA环化策略，以核酶环化法最为常用，多项研究基于这个策略进行了技术升级。

● I型内含子自剪接法

清华大学喻国灿、新加坡国立大学永禄林医学院陈小元联合山西高等创新研究院刘志达团队，基于I型内含子建立的增强型嵌合PIE系统（CPIE系统），可实现RNA高效环状化，最大限度减少circRNA中残留多余序列。^[47]而复旦大学章旭耀团队联合美国宾夕法尼亚大学华先欣团队同样基于I型内含子建立的Hi-Scarless-PIE实现了circRNA的量产、无痕（no scar）制备。^[45]

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● II型内含子自剪接法

美国加州大学Prashant Mali团队基于II型内含子开发的平台可以有效体外制备circRNA (ocRNA)，还可以利用内源性普遍表达的RtcB蛋白在细胞内环化生成circRNA (icRNA)。^[39]

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● 顺式作用连接酶核酶法

中国台湾国家卫生研究院余佳益团队利用系统筛选的顺式作用连接酶核酶（RzL）对单链RNA进行共价环化，最小化了RzL作用所需的RNA序列，RzL策略高度依赖于酶-底物RNA配对产生circRNA，因而没有RNA副产物。^[40]

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艾博生物英博团队开发高效成环顺式剪接系统（Cis系统），可延长蛋白表达时间、降低免疫原性，并具有剪接位点设计灵活性等优势。^[48]

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● 反式作用连接酶核酶法

英国MRC分子生物学实验室Venki Ramakrishnan团队基于反式核酶开发TRIC和TERIC的RNA环化方法，可以实现RNA的高效环化，提高产量，且可合成长序列和完全修饰的circRNA。^[9]

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● RNA LEGO

此外，麻省理工学院化学系/Broad研究所王潇团队基于多种连接酶的mRNA-寡聚核苷酸组装策略（RNA LEGO），对circRNA化学修饰和拓扑结构改造，大幅提高了其在小鼠体内的蛋白生产能力，为mRNA翻译起始机制及相关化学修饰设计提供了新见解。^[49]

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纯化策略

circRNA因合成策略复杂及多样化，纯化仍是制备的关键难题。目前，纯化策略主要包括核酸外切酶去除线性RNA杂质，磷酸酶中和免疫原性三磷酸基团，以及凝胶电泳、HPLC、亲和层析和超滤等分离技术。然而，开发circRNA新疗法需优化大规模纯化策略，以实现高纯度和高产量。

中国食品药品检定研究院徐苗团队建立RT-HPLC纯化法，明显分离circRNA、nicked RNA和precusorRNA，可用于分析circRNA疫苗纯度及降解产物。同时，研究还发现在热加速稳定性实验中，circRNA 降解模式为：

circRNA→Nicked→RNA降解片段。^[50]

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西班牙 Certest Biotec S.L公司团队在circRNA序列中添加PloyA，利用Oligo dT亲和层析技术纯化circRNA，得到circRNA的占比更高，且在细胞水平和体内的表达效果均优于kit试剂盒以及HPLC纯化得到的circRNA。^[51]

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中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室曹宇虹团队利用纤维素过滤去除dsDNA，结合酶处理的逐步纯化策略，用于circRNA纯化，显著提高circRNA回收率，降低免疫原性。^[52]

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类似地，美国克莱姆森大学Scott M. Husson团队利用聚醚砜（PES）膜从IVT产物中超滤纯化circRNA，大幅提升纯度及产率，突出了超滤在研究规模上是一种优越的circRNA纯化方法，也可以在基于circRNA的治疗药物的大规模生产中发挥关键作用。^[53]

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递送策略

基于mRNA疫苗的成功经验，纳米脂质颗粒（LNP）已成为当前主流的RNA递送系统。然而，针对circRNA更高效、精准和安全的递送需求，LNP体系仍需进一步优化。优化策略主要包括调整脂质比例、改变脂质特性以及添加非脂质成分等。综合成本、疗效与安全性，改变脂质特性成为当前较主流的策略。

● 添加非脂质成分LNP

华中农业大学赵凌团队利用马来酰亚胺/硫醇将anti-DEC-205抗体共轭修饰到LNP，可促进靶向淋巴结递送circRNA。^[25]

推荐阅读：靶向淋巴结的circRNA疫苗共表达佐剂和抗原，解锁单剂量疫苗开发潜力！

● 改变脂质特性LNP

多伦多大学李博文团队引入组合化学的Ugi四组分反应合成并筛选针对特定肿瘤定制的LNP，在肺癌细胞中转染circRNA疫苗的效率比行业标准LNP（ALC-0315）提高了四倍，同时提供了有效的免疫激活。^[28]

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环码生物杨赟联合北京大学邓觅/苗蕾团队开发含有新型拟心磷脂磷酰胺脂质的LNP，增加了硬度和相分离，促进T细胞偏向性摄取。^[35]

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复旦大学璩良团队通过改造LNP中阳离子脂质头部和尾部基团，可得到免疫细胞趋向性的LNP体内有效递送circRNA。^[34]

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科锐迈德孙振华、普瑞康生物曹辉联合东南大学-莫纳什大学联合研究院佟振博团队具有支链尾部和五个酯键的专有可电离甘油脂质（TG6A），使用TG6A构建的LNP成功向间充质干细胞转染circRNA。^[36]

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● GSer-CARTs

除了LNP这种典型多阴离子转运体外，斯坦福大学张元豪和Wender团队还有研究通过电荷抵消动态控制胍离子活动性开发的肝外靶向、可调控、可预测的GSer-CARTs转运体，实现了circOVA的体内高效递送。^[27]

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临床进展

circRNA的临床转化，既依赖基础研究突破，也需要产业生态推动。2024年，行业协同发力，融资为产业发展注入动力，广泛合作带来前沿理念与创新思维，circRNA药物开发事业迈向新高度。

一 临床试验阶段

FDA批准首个IND

转录本生物（RiboX）（中国）

转录本生物在研疗法RXRG001的IND获得许可，即将在美国开展临床试验SPRINX-1。RXRG001是全球首个获美国食品药品监督管理局（FDA）批准进入IND的circRNA疗法，SPRINX-1试验将评估其在辐射诱导的口干症和唾液分泌减退患者中的安全性和有效性。

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NMPA批准首个IND

环码生物（CirCode）（中国）

环码生物用于治疗缺血性心脏病的HM2002注射液在上海交通大学医学院附属瑞金医院开展IIT试验并完成首例患者注射给药。三个月后，HM2002注射液成为中国首个获得国家药品监督管理局（NMPA）临床试验许可（IND）的环形RNA药物。

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截至本文发布日，CirCode官网公布的管线分布与进展

二 临床前研究阶段

Orna Therapeutics（美国）

Orna Therapeutics在2024年收购ReNAgade Therapeutics，双强携手推进用于治疗肿瘤和自身免疫性疾病的新型体内RNA疗法panCAR项目的开发。在ESGCT年会上，Orna展示了研究数据：来自健康供体的原代造血干细胞祖细胞（HSPC）的编辑率显著提高到约80%。Orna的STEM技术旨在解决β血红蛋白病，包括镰状细胞病（SCD）和输血依赖性β地中海贫血（TDT）。

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截至本文发布日，Orna Therapeutics官网公布的管线分布与进展

Sail Biomedicines（美国）

Sail Biomedicines宣布获得比尔&梅林达·盖茨基金会的两笔赞助，用于推进Endless RNA平台开发治疗疟疾的分泌型单克隆抗体和疫苗。随后，Sail Biomedicines公布Endless RNA平台可能为那些不适用现有治疗的10%-15%囊性纤维化患者提供治疗选择。

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截至本文发布日，Sail Biomedicines官网公布的管线分布与进展

Circular Genomics（美国）

Circular Genomics在新年伊始完成2024年circRNA全球领域的首笔融资，为推出全球首个基于circRNA的临床检测做准备。Michael F. Ackermann博士的加入，将为其助推首个circRNA抗抑郁疗法。

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截至本文发布日，Circular Genomics官网公布的管线分布与进展

Circio（挪威）

Circio除了开发针对KRAS突变的癌症疫苗外，还建立了circRNA平台circVec，利用DNA和病毒载体生产多功能circRNA。在2024年第27届ASGCT年会上，Circio展示了circRNA与线性mRNA相比在体内的优越性，以及Circio的“移除和替代（remove-&-replace）” 基因疗法的技术概念验证，该疗法可满足α1－抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）的医疗需求。

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截至本文发布日，Circio官网公布的管线分布与进展

Ginkgo Bioworks（美国）

Ginkgo Bioworks收购用于序列设计的人工智能平台Patch Biosciences，以加强其研发管线，强化circRNA和启动子筛选平台技术。

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休斯顿卫理公会研究所（美国）

全球卫生非营利组织流行病防范创新联盟（CEPI）与美国休斯顿卫理公会研究所（HMRI）合作，重点关注circRNA候选疫苗的设计和临床前评估，为疫苗平台建立临床前概念验证。

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展望

2024中国龙年，circRNA领域从基础研究，到转化应用都取得了丰硕成果，circRNA药物开发更是实现了临床里程碑式的突破，振奋人心。然而，circRNA创新疗法的未来发展仍面临诸多问题与挑战。

circRNA转化应用研究有待加强

作为新型核酸技术，circRNA创新疗法在序列设计、翻译效率、功能机制、免疫原性等关键领域的研究尚不够深入，有待进一步挖掘。这需要借助空间多组学技术以及人工智能等多学科的交叉融合，全方位深入挖掘circRNA的功能特性。创新疗法的开发方向不仅局限于蛋白表达，还应拓展基因编辑工具、核酸适配体等药物开发方向，为创新治疗提供更多靶点与策略。

circRNA共性关键技术亟待攻克

工程化circRNA的合成、纯化与递送策略，虽解决方案多样，但个性化特征明显，缺乏统一且高效的通用模式。在原液放大生产环节，需筛选并开发更优的序列设计、环化及纯化策略，以提高产量，同时降低副产物生成。在药物递送环节，亟需开发出安全性更高、效率更优且靶向性更强的递送材料，以满足不同适应症的多样化需求，切实解决circRNA药物递送的关键瓶颈问题。

政策支持与监管机制需加速完善

中国两家企业的circRNA药物获得IND批准，充分彰显了我国在circRNA药物研发领域处于全球领先地位。如何保持领先优势，加速推进产业化，成为摆在眼前的重要课题。政策层面，需加快推进以疾病预防与治疗为导向的临床转化研究，大力支持研究者发起的临床研究（IIT），加速创新疗法安全性与有效性的验证。监管层面，要持续完善相关审评审批程序，加快制定并出台circRNA临床审批标准，推动circRNA前沿技术的产业化进程。

尽管circRNA领域挑战重重，但circRNA疗法未来前景依然可期。期待学术界、产业界与投资界携手共进，让circRNA“暗物质”发出光芒，造福人类健康。

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重大突破！环码生物环形RNA疗法摘下国内NMPA临床试验许可首冠

admin — Mon, 13 Jan 2025 06:27:05 +0000

2025年1月10日，上海环码生物医药有限公司（以下简称“环码生物”）自主研发的环形RNA药物-HM2002注射液获得国家药品监督管理局（NMPA）临床试验许可（IND），用于治疗缺血性心脏病（Ischemic Heart Disease ，IHD）。这是首个获得NMPA临床试验许可的环形RNA生物制品，充分体现了环码生物的科研创新能力，是公司作为“环形RNA疗法引领者”的具体实践，也提升了中国在环形RNA制药领域的领先地位。

1 CirCode 聚焦未满足的治疗需求：缺血性心脏病

缺血性心脏病是一种由冠状动脉粥样硬化引起的严重心血管疾病，因血管狭窄或阻塞导致心肌供血不足，进而引发心肌缺血甚至坏死。随着全球人口老龄化和生活方式的改变，IHD的发病率持续上升，已成为全球范围内威胁公共健康的主要疾病之一。然而，目前的治疗手段在促进心肌微循环重建和血管新生方面成效有限，迫切需要更高效的新型疗法来改善患者的预后和生活质量。

2 CirCode HM2002注射液：突破性的环形RNA疗法

HM2002注射液是基于环码生物自主创新技术平台研发的新一代环形RNA药物，专为治疗缺血性心脏病设计。该疗法通过在心肌内稳定表达血管内皮生长因子（VEGF），显著促进血管新生与心肌灌注，从而加速心功能恢复。与传统线性RNA相比，HM2002所采用的环形RNA技术具有更高的稳定性和更低的免疫原性，在治疗应用中展现了独特的优势。

2024年8月，上海交通大学附属瑞金医院心脏外科赵强教授团队启动了一项研究者发起的临床试验（IIT），探索HM2002注射液在接受冠状动脉旁路移植术（CABG）的IHD患者中，经心外膜心肌内给药的安全性和初步疗效。至2024年10月，已经完成了全部患者的注射给药。初步结果显示，所有患者均恢复良好，未观察到药物相关的不良事件，心功能较术前均有显著改善。目前，患者随访工作仍在持续进行中。这些研究数据为HM2002注射液的安全性和潜在疗效提供了积极的支持，也为后续的临床试验奠定了坚实基础。

HM2002注射液的NMPA临床试验批准，标志着环码生物在环形RNA药物开发领域迈出了关键一步，同时为中国原创生物技术在高端生物医药领域树立了新的标杆。环码生物将继续深耕环形RNA药物的研发与临床应用，推动HM2002注射液的临床研究进程，并探索环形RNA在其他适应症中的潜力应用，开发更多突破性疗法，为广大患者带来新的希望与福音。

关于环码

环码生物（CirCode），是全球领先的环形RNA疗法的引领者，先后荣获国家级高新技术企业、上海市专精特新中小企业等多项殊荣。公司基于自主研发的多项关键技术，打造了全链条自主可控的环形RNA技术平台，构筑了完善的全球专利保护体系，为环形RNA药物开发扫清障碍。环码生物从未被满足的临床需求出发，储备管线覆盖多个治疗领域：传染病疫苗、心血管、自身免疫性疾病、肿瘤等。公司凭借自身优势，在产业领域备受瞩目，吸引众多知名投资机构关注，成功斩获数亿元融资，为公司发展注入强劲动力。环码生物已与多家国际知名药企达成合作，共同探索及开发环形RNA疗法的潜力，推动更多以环形RNA技术为疗法的药物的创新。环码生物将持续推动科学技术成就的转化，造福广大病患，让天下没有难治的病。

国内首个环状RNA药物HM2002注射液临床试验申请获CDE受理！

admin — Wed, 30 Oct 2024 08:36:34 +0000

2024年10月30日，国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）官网公示，上海环码生物医药有限公司（以下简称“环码生物”）自主研发的创新环形RNA药物HM2002注射液的新药临床试验申请（IND）已被CDE正式受理。该药物旨在治疗缺血性心脏病（IHD），这标志着国内circRNA疗法的临床申报首次获得了CDE的正式受理！

来源：CDE官网

回顾

环形RNA药物-HM2002注射液是专门为“治疗性血管新生”打造的全新基因治疗药物，其临床前研究结果显示，在心肌梗死动物模型中，HM2002注射液能够促进血管再生，减少梗死和纤维化面积，显著改善心功能，有望为缺血性心脏病的治疗提供新的选择。

2024年8月14日，基于HM2002注射液的研究者发起的临床试验（IIT）研究上海交通大学医学院附属瑞金医院正式启动。

2024年9月18日，上海交通大学附属瑞金医院心脏外科赵强教授带领团队，在接受冠状动脉旁路移植术（CABG）的缺血性心力衰竭患者中，成功完成了全球首例HM2002注射液的经心外膜心肌注射给药。

2024年9月24日，该患者已转入普通病房，接受二级护理，生命体征和各项临床指标均保持稳定。IIT试验的主要目标是初步评估在CABG手术中应用HM2002注射液的可行性与安全性，重点监测药物的治疗反应。

circRNA研究汇总丨20241008-20241014

admin — Mon, 14 Oct 2024 06:17:28 +0000

欢迎来到“circRNA研究汇总”栏目，本栏目将为您带来circRNA领域的最新研究成果。本期我们精选了10篇最新文献，涵盖了circRNA的基础研究、功能探究以及与疾病的关联。请您紧跟circRNA研究的步伐，共同洞悉科研前沿的最新动态！

检索式：(circRNA[Title/Abstract]) OR (circular RNA[Title/Abstract]) OR (circular mRNA[Title/Abstract])

01 RNA 疫苗在肿瘤治疗中的进展与应用

标题：Advances and applications of RNA vaccines in tumor treatment

杂志：Mol Cancer

影响因子：27.7

通讯作者：崔久嵬教授（吉林大学第一医院肿瘤中心）

DOI: 10.1186/s12943-024-02141-5

与其他类型的肿瘤疫苗相比，RNA 疫苗因其高效、快速开发能力以及低成本制造和安全药物递送的潜力，已成为传统疫苗疗法的有前途的替代方案。RNA 疫苗主要包括 mRNA、环状 RNA（circRNA）和自我扩增 mRNA（SAM）。针对不同肿瘤的不同 RNA 疫苗平台在动物和人类模型中均显示出令人鼓舞的结果。本综述全面描述了 RNA 疫苗在抗肿瘤治疗中的进展和应用。还讨论了将这一有前途的疫苗平台扩展到广泛治疗用途的未来方向。

02 cNEK6 通过 SNRPA/PPA2c/mTORC1 轴促进胰腺导管腺癌中的糖酵解从而诱导吉西他滨耐药性

标题：cNEK6 induces gemcitabine resistance by promoting glycolysis in pancreatic ductal adenocarcinoma via the SNRPA/PPA2c/mTORC1 axis

杂志：Cell Death Dis

影响因子：8.1

通讯作者：陈江枝副主任医师、陈实副教授、陈燕凌教授（福建医科大学）

DOI: 10.1038/s41419-024-07138-y

胰腺导管腺癌（PDAC）对吉西他滨的耐药性导致化疗无效，进而延迟治疗，从而导致不良预后。糖酵解是吉西他滨耐药的重要内在原因，它通过促进 PDAC 中脱氧胞苷三磷酸的积累来竞争性抑制吉西他滨的活性。然而，缺乏生物标志物来确定哪些患者在吉西他滨活性治疗下能从糖酵解抑制中显著受益，而全面了解促进 PDAC 中糖酵解的分子机制将有助于制定提高吉西他滨化疗敏感性的策略。在这项研究中，该研究团队旨在确定一种能够可靠地指示 PDAC 对吉西他滨内在耐药性的生物标志物，并指导化疗增敏策略。该研究团队在实验室建立吉西他滨耐药细胞系，收集吉西他滨治疗患者的胰腺癌及邻近正常组织，观察到circRNA hsa_circ_0008383（即cNEK6）在吉西他滨耐药PDAC患者及异种移植物的外周血和肿瘤组织中高表达。cNEK6 通过促进 PDAC 中的糖酵解来增强对吉西他滨的耐药性。具体而言，cNEK6 阻止了来自泛素 E3 连接酶 BTRC 的小核糖核蛋白肽 A 的 K48 泛素化；因此，积累的 SNRPA 通过与 mRNA 的 5’UTR 中的 G – 四链体结合来阻止 PP2Ac 的翻译。由于缺乏 PP2Ac，mTORC1 通路被异常磷酸化并激活。cNEK6 在外周血和肿瘤组织中的表达水平与 mTORC1 通路的激活和糖酵解程度显著正相关。因此，吉西他滨在 cNEK6 水平高的患者中的治疗效果有限，与 mTORC1 抑制剂雷帕霉素联合使用可以增强对吉西他滨化疗的敏感性。

研究汇总列表

环形RNA药物-HM2002注射液完成首例患者给药，正式进入临床试验阶段！

admin — Thu, 26 Sep 2024 08:14:28 +0000

2024年9月18日，上海交通大学附属瑞金医院心脏外科赵强教授带领团队，在接受冠状动脉旁路移植术（CABG）的缺血性心力衰竭患者中，成功完成了全球首例HM2002注射液的经心外膜心肌注射给药。这一突破性进展，标志着环形RNA类药物正式迈入人体临床试验（First-in-Human）的新阶段，为后续研发迈出了坚实的第一步。

2024年9月24日，该患者已转入普通病房，接受二级护理，生命体征和各项临床指标均保持稳定。截至发稿日，未报告任何与药物相关的不良事件。

环形RNA药物-HM2002注射液首次人体研究是一项研究者发起的探索性研究（IIT），由赵强教授担任主要研究者。试验的主要目标是初步评估在CABG手术中应用HM2002注射液的可行性与安全性，重点监测药物的治疗反应。

赵强教授表示：“成功完成首例患者的给药操作是该研究的重要里程碑，环形RNA药物在缺血性心脏病的治疗中展现出巨大的潜力。我们期待通过后续的临床试验，进一步验证HM2002注射液的安全性及疗效，期待这一疗法能为缺血性心脏病患者带来新的治疗希望。”

关于HM2002注射液

HM2002注射液是一种创新的环形RNA（circRNA）药物，由上海环码生物医药有限公司研发。临床前研究结果显示，在心肌梗死动物模型中，HM2002注射液能够促进血管再生，减少梗死和纤维化面积，显著改善心功能，有望为缺血性心脏病的治疗提供新的选择

全球首创！环形RNA疗法首个临床研究在瑞金医院心血管外科启动

admin — Fri, 23 Aug 2024 05:52:33 +0000

缺血性心脏病（IHD）在全球范围内仍然是导致疾病和死亡的主要原因之一，目前的临床干预手段不能有效恢复受损的微血管功能，因此部分心肌细胞在血运重建后依然持续性缺血。在我国，缺血性心脏病死亡率呈明显上升趋势，传统治疗方法包括药物治疗、血管介入成形术和外科冠脉旁路移植术，这些方法虽然明显提高了心肌梗死的生存率和生活质量，但对坏死心肌作用有限，尤其对弥漫性冠状动脉病变难以奏效，心肌梗死已成为心力衰竭的首要原因。

治疗性血管新生又称“分子搭桥术”或“生物搭桥术”，为缺血性心脏病病人提供了全新的治疗策略。目前治疗性血管新生的方法主要包括蛋白治疗、细胞治疗和基因治疗等。多种血管生长因子，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管生成素和肝细胞生长因子等能诱导缺血心肌血管新生并改善心脏功能。

2024年8月14日，环形RNA药物-HM2002注射液首个临床试验在上海交通大学医学院附属瑞金医院正式启动。该研究是一项研究者发起的临床试验（IIT）研究，由瑞金医院心血管外科赵强教授发起，主要目的是评价在接受冠状动脉旁路移植术（CABG）的缺血性心力衰竭患者中使用环形RNA药物HM2002注射液的安全性和耐受性。环码生物科学创始人王泽峰教授确认出席第八届circRNA研究与产业论坛，并发表主题演讲，敬请期待！

环形RNA药物-HM2002注射液正是专门为“治疗性血管新生”打造的全新基因治疗药物，本研究的启动也标志着HM2002注射液的研发进入“临床试验”阶段。

赵强教授表示：环形RNA-HM2002注射液首次人体研究能在瑞金医院心外科开展离不开医院院领导和科研发展处的支持。得益于我院积极鼓励临床新技术、新疗法的科研政策，以及完善的科研立项、学术审查、伦理审查制度，本研究才能顺利启动。

环码生物首席执行官汤辰翔博士表示：“环形RNA是全新的一种药物类型，HM2002在临床前动物实验中展现出了出色的药效及极好的安全性。感谢瑞金医院、赵强教授团队对公司及产品的信任与支持，相信在赵教授团队的积极推动下，HM2002将成为全球首款为病患带来获益的环形RNA药物。”

关于环形RNA

环形RNA是一类共价闭合的单链RNA分子，在人体内广泛存在。环形RNA因为特殊的构象使其比线性RNA更稳定，可以在体内更持久的表达目的蛋白，在治疗中发挥更持久的药效。同时，环形RNA在不添加修饰核苷酸的情况下，免疫原性就非常低，降低了候选药物潜在的副作用。因此，环形RNA提供了更宽的治疗窗口和更好的安全性，具有潜在的临床优势。

关于环码

环码生物是一家专注于环形RNA药物开发的创新生物技术公司。与线性RNA相比，环形RNA拥有更好的稳定性及更低的免疫原性，使其在治疗领域拥有更大的优势。环码生物完成了多项关键环形RNA技术的开发并搭建了完善的全球专利保护体系，这些技术为环形RNA药物开发铺平了道路。环码生物将积极推动科学技术成就的转化，造福广大病患。了解更多，请访问www.circodebio.com.

封面文章 | 中山眼科中心谢志团队利用LNP-circNGF为视网膜神经节细胞提供持续和强效的保护

admin — Fri, 23 Aug 2024 03:48:03 +0000

项目背景

青光眼等视网膜神经退行性疾病会导致视网膜神经节细胞（RGC）的进行性退化，最终导致不可逆的视力丧失。目前的治疗方法，如降低眼压，只能延缓疾病进展，无法有效保护RGCs；神经生长因子（NGF）的重组蛋白已在临床上使用多年，但是临床效果不佳。因此，开发新的神经保护策略对于预防失明至关重要。

近日，中山大学中山眼科中心谢志教授的研究团队在《Molecular Therapy: Nucleic Acids》杂志上发表文章：Circular RNA-based therapy provides sustained and robust neuroprotection for retinal ganglion cells，为治疗青光眼等视网膜神经退行性疾病提供了新的希望。这项研究不仅展示了新型的mRNA治疗方法的潜力，还为开发针对多种眼部疾病的创新疗法奠定了基础。该文章也被选为当期封面。

一、mRNA和环形mRNA疗法简介

近年来，mRNA疗法因在新冠疫苗中的成功应用而备受关注。这种技术通过递送编码特定蛋白质的mRNA，使细胞能够生产所需的治疗性蛋白质。然而，传统的线性mRNA容易被降解，导致蛋白质表达时间短暂。环形RNA（circRNA）是一种新兴的RNA分子，其独特的闭合环状结构使其比线性RNA更稳定，能够抵抗细胞内的RNA降解酶。研究人员发现，利用环形的mRNA可以实现更持久的蛋白质表达，这为开发长效mRNA治疗策略提供了新的可能性。

二、研究内容和结果

中山眼科中心的研究团队开发出一种基于环形mRNA的创新疗法，通过表达NGF的mRNA来保护视网膜神经节细胞。他们将表达NGF的环形mRNA包裹在脂质纳米颗粒（LNP）中，形成LNP-circNGF复合物，以实现高效的细胞内递送。在小鼠视神经挫伤模型中，研究人员发现LNP-circNGF能显著提高视网膜神经节细胞的存活率，远优于重组NGF蛋白治疗。具体而言：

1、环形mRNA比线性mRNA显著延长了蛋白质表达时间

图1. 利用环形和线性mRNA表达荧光蛋白以及NGF，circ:环形；lin:线性

2、LNP-circNGF治疗组比重组NGF蛋白治疗组的RGC存活率显著提高

图2. pNGF: 重组NGF蛋白；LNP-NGF: LNP包裹的环形NGF mRNA; IVT: 玻璃体腔注射

3、LNP-circNGF显著促进了受损视神经轴突的存活和延伸

图3. pNGF: 重组NGF蛋白；LNP-circNGF: LNP包裹的环形NGF mRNA

4、单细胞测序分析揭示了LNP-circNGF的多方面治疗作用，包括增强视觉感知相关基因表达和减少创伤相关改变

图4. RGC细胞的差异表达基因的通路富集分析

总结

该研究的通讯作者谢志教授表示：”这是眼科领域里首次利用mRNA进行蛋白替代疗法的尝试，我们的研究为开发治疗视网膜神经退行性疾病的新策略提供了依据，mRNA疗法有望成为一种安全、持久和高效的蛋白质递送平台，我们希望能够和广大的科研以及产业的相关团队合作，一起推动mRNA药物在眼科疾病以及更广泛的疾病的应用”。

研究团队计划进行进一步的优化和临床前研究，以推动这一创新疗法向临床应用迈进，为眼科患者带来的实际益处。

研究团队负责人简介

谢志，中山大学中山眼科中心教授，中山大学健康医疗大数据国家研究院副院长、广东省生物信息学会理事长。重庆医科大学临床医学本科，新西兰林肯大学应用计算专业一级荣誉学士以及计算系统生物学博士学位，美国约翰霍普金斯大学医学院博士后，原美国国家癌症研究院研究员。开展RNA生物学以及生命科学人工智能研究和应用，在《Cell》，《Nature Methods》等国际期刊发表学术论文80余篇，影响因子超过800分，H-index：35。研究方向包括：(1) 人工智能mRNA药物设计；(2) 高通量组学数据分析和方法开发；(3) 抗衰老及组织修复。

原文链接

https://www.cell.com/molecular-therapy-family/nucleic-acids/fulltext/S2162-2531(24)00145-8

Research丨新型circRNA circITGa9诱导心脏重塑和纤维化

admin — Fri, 01 Mar 2024 07:46:58 +0000

最近的研究表明circRNA(circRNAs)在心血管疾病中具有非常重要的作用。因此，阐明心血管疾病与circRNAs相关的调节机制对心血管疾病预防和治疗至关重要。

2023年2月，加拿大多伦多大学杨柏华教授团队在Research（IF=11.0)发表文章“A Novel Circular RNA circITGa9 Predominantly Generated in Human Heart Disease Induces Cardiac Remodeling and Fibrosis”，在本文中，作者发现了32,034个以前未发现的具有不同心脏表达模式的circRNA。值得注意的是，由整合素-α9衍生的circRNA circITGa9在心肌肥厚患者中表现出明显的上调。且circITGa9可通过结合原肌球蛋白3(TPM3)调节诱导肌动蛋白聚合，从而影响心脏组织纤维化。最后，作者开发了靶向circITGa9的阻断寡聚物抑制circITGa9和TPM3相互作用改善心脏功能和减少纤维化，该寡聚物可用于进一步的临床前和转化开发。综上所述，circITGa9水平升高驱动心脏重塑和纤维化。通过确定circITGa9作为治疗靶点，作者为减轻心脏重塑和纤维化的创新干预提供新的思路。

1、心肌肥厚患者circITGa9水平升高

首先作者对患有心脏疾病或正常人类的心脏组织进行测序分析后共鉴定出45284个circRNA，其中13250个已经在circBase中报道，而其余的32034个circRNA此前未被报道。GO分析显示在总共涉及11243个基因的2900个功能中，有13个功能达到显著水平。参与这13种功能的基因数为295个。在295个基因中，只有整合素-α9（integrin-α9）的基因ID ENSG00000144668出现在全部13个功能特征中。KEGG通路分析显示ENSG00000144668参与肥厚性心肌病、扩张性心肌病、细胞粘附分子等3条通路，该通路在心脏重塑中很重要。有趣的是，在上调的circRNA中，hg38_circ_0030600(circITGa9)显著上调，且其序列来自整合素-α9的第14和15个外显子。当使用siRNA沉默circITGa9时，纤维化相关标志包括成纤维细胞粘附、增殖、转化生长因子-β (TGF-β)表达减少和胶原沉积的变化最为显著，但心肌细胞活力增加。此外，73例心脏肥厚患者和25例正常心脏标本中，患者标本中的circITGa9水平明显高于对照样本。数字液滴PCR结果显示，与对照样品相比，患者标本中circITGa9的拷贝数显着增加，从而表明circITGa9在心脏疾病诱导的纤维化中具有非常重要的作用。

Fig 1. circRNA在心脏肥厚患者组织中的表达

2、circITGa9对心脏功能的影响

为了进一步探究circITGa9对心脏功能的影响，作者通过主动脉缩窄术（TAC）对小鼠进行处理。结果显示，TAC后内源性circITGa9水平在心脏组织中增加最多，其次是主动脉和脑组织。为了研究circITGa9在心脏功能中的作用，作者构建了一个人circITGa9的过表达载体和一个缺乏环化序列的线性质粒，随后将纳米颗粒结合的人circITGa9表达质粒和线性质粒注射到TAC小鼠腹膜中。实验结果显示，处理8周后内源性小鼠circITGa9和人circITGa9在心脏中的表达水平显著升高。在使用Vevo 2100成像系统进行心功能测量后发现，与对照组相比过表达circITGa9使TAC小鼠左心室收缩末期直径(LVESD)和左心室舒张末期直径(LVEDD)显著增加，而LVESD-LVEDD显示出显著减少。此外，作者还观察到左心室压(dp/dt )，左心室射血分数(LVEF)和左心室分数缩短(LVFS)。M型图显示注射circITGa9表达质粒后TAC心脏心室收缩减弱，表明与对照组相比circITGa9过表达组的心脏功能下降。

然后作者设计了2个针对circITGa9连接序列的siRNA。将siRNA与金纳米颗粒结合，并将其送入TAC小鼠体内后发现，虽然TAC后8周心脏中circITGa9水平显著升高，但siRNA仍然降低了circITGa9水平。在沉默circITGa9的TAC小鼠心功能测量中，作者检测到LVESD和LVEDD显著降低，但LVESD-LVEDD显示出显著增加。作者还发现左室压、LVEF、LVEF和LVFS显著升高。M型超声显示沉默circITGa9可预防TA引起的左室收缩减少。

Fig 2. circITGa9过表达降低心脏功能

3、circITGa9对心脏纤维化的影响

由于心脏纤维化是与心脏肥厚重塑密切相关的主要结果之一，作者通过对心脏组织进行马松三色和天狼星红染色观察胶原沉积，从而研究circITGa9在心脏纤维化中的作用。定量分析显示，与对照组相比，TAC小鼠心脏中马松三色和天狼星红染色明显增加，而通过注射递送过表达circITGa9进一步增加了TAC小鼠的胶原沉积。qPCR结果显示，TAC小鼠的胶原I和胶原III表达显著上调，表明circITGa9过表达进一步增加心脏胶原水平，导致纤维化增强。在沉默circITGa9后，心脏组织中马松三色和天狼星红水平明显降低，胶原沉积水平降低。此外，qPCR结果显示这些心脏组织中胶原I和胶原III明显减少。在患者标本中，胶原I水平与circITGa9表达呈正相关，而circITGa9表达与心功能呈负相关。

Fig 3.circITGa9对压力过载心脏纤维化的影响

4、circITGa9通过与原肌球蛋白3结合调节肌动蛋白聚合

为了揭示可能参与介导circITGa9在心脏纤维化功能的下游分子，通过免疫共沉淀及蛋白质谱，作者检测到原肌球蛋白3(TPM3)能够与circITGa9结合。为了验证质谱分析结果，作者将circITGa9表达构建体和对照载体转染至MCF细胞中并利用TPM3抗体钓取circITGa9。结果显示，与线性载体相比TPM3抗体在circITGa9过表达组中显著富集到circITGa9。此外，使用circITGa9探针对结合蛋白进行Pulldown，并通过TPM3抗体对Pulldown产物进行Western blot检测时也能够检测到TPM3蛋白，表明circITGa9与TPM3能够特异性结合。

Fig 4.circITGa9与TPM3的结合

原肌凝蛋白在稳定肌动蛋白丝中起着至关重要的作用，而原肌凝蛋白与肌动蛋白之间的构象变化导致了肌动蛋白聚合。肌动蛋白聚合在调节细胞活动中起重要作用，且与组织纤维化密切相关。因此，作者检测了circITGa9和TPM3的结合是否通过调节肌动蛋白聚合来影响心脏纤维化。实验结果发现，从circITGa9过表达促使MCF细胞肌动蛋白聚合增加。为了进一步阐明circITGa9功能的相关机制，使用circITGa9转染HEK-293T细胞，并利用TPM3和肌动蛋白抗体进行共免疫沉淀试验。实验结果发现，circITGa9的表达抑制了TPM3和γ-actin之间的相互作用。在人心脏组织的原位杂交和免疫荧光染色中，作者观察到与正常心脏组织相比，肥厚心脏组织中circITGa9和F-actin水平升高，且circITGa9与TPM3在细胞中共定位。

为了进一步证实circITGa9与TPM3的结合活性，作者对结合位点进行定点突变，且结合位点的突变不影响突变体circITGa9的环状化。在进行免疫共沉淀实验后发现，结合位点突变抑制了TPM3抗体对circITGa9的富集。相对的，当突变体转染MCF细胞时，circITGa9探针也不能再调取到TPM3。随后，作者对注射了突变载体的TAC小鼠进行了心功能检测，检测到LVESD和LVEDD显著降低，但LVESD-LVEDD显示显著增加。作者还发现左室压、LVEF(图7F)、LVFS显著升高。M型超声图显示，相对于circITGa9组，circITGa9对TAC小鼠心脏功能的影响减弱。综上所述，circITGa9通过与原肌球蛋白3结合调节肌动蛋白聚合，从而影响心脏纤维化。

Fig 5.circITGa9通过结合TPM3影响心脏功能

5、心脏纤维化的干预

为了探索开发治疗方法的潜力，作者合成了阻断寡聚物（Blocking oligos）来阻断circITGa9与TPM3的结合。qPCR分析显示，阻断circITGa9结合位点可显著减少circITGa9与TPM3的结合。M型图显示，阻断circITGa9与TPM3相互作用后，TAC心脏左室收缩功能增强。在注射阻断寡聚物的TAC小鼠心功能测量中，作者观察到LVEDD和LVESD显著降低，LVESD-LVEDD显著增加。作者还检测到左心室压显著增加，LVFS和LVEF显著增加，表明TAC小鼠心功能改善。

此外，在给予阻断寡聚物的TAC小鼠心脏切片中，马松三色和天狼星红染色显示其染色水平和胶原沉积水平降低。qPCR检测发现心脏组织中胶原I和胶原III明显减少。在细胞活性测定中，作者发现转染阻断寡聚物降低了原代分离的心脏成纤维细胞的存活、粘附和迁移。

Fig 6.阻断circITGa9的作用

总结

综上所述，在本文中作者证明了circITGa9与TPM3和γ-肌动蛋白形成复合物，促进肌动蛋白聚合，从而调节心脏纤维化。

Cardiovasc Res丨上海大学肖俊杰教授团队发现环状RNA circUtrn可抑制心肌缺血-再灌注损伤和病理性心脏重构

admin — Tue, 14 Nov 2023 09:06:35 +0000

定期进行运动训练有益于心血管健康，并能有效降低罹患心血管疾病的风险。环状RNA（circRNA）在心脏病理生理学中发挥重要作用。然而，circRNA 在运动训练中的作用以及运动诱导心脏保护的生物机制仍然需要进一步探索。

2023年10月28日，上海大学附属南通第六人民医院和上海大学生命科学学院肖俊杰教授团队在Cardiovascular Research(IF=10.8)发表文章”Exercise-induced circular RNA circUtrn is required for cardiac physiological hypertrophy and prevents myocardial ischemia-reperfusion injury”。本研究表明环状RNA circUtrn是运动诱导生理性心肌肥厚发展所必需的，抑制CircUtrn可消除运动对I/R重构的保护作用。此外，circUtrn过表达可防止心肌I/R诱导的急性损伤和病理性心脏重构。本研究结果表明，circUtrn升高及其对I/R损伤的保护作用可能对I/R损伤和病理心脏重构具有治疗前景。

成年小鼠心肌细胞游泳运动训练中环状RNA表达的鉴定

作者首先通过4周游泳训练小鼠，构建运动诱导的生理性心肌肥厚模型，然后收集成年小鼠心肌细胞，进行RNA测序并分析circRNA的表达。选择了9个差异显著的circRNA，并分析它们在4个病理性心脏模型中的表达，发现circRNA_0191，专门参与运动诱导心脏生长，命名为circUtrn进一步分析（图1A-C）。

通过circBank数据库集和序列比对，发现circUtrn在人类和小鼠之间高度保守（补充图S2）。特异性PCR产物可通过不同的引物从cDNA中扩增，但不能从gDNA中扩增。此外，Sanger测序证实了circUtrn的反向剪接位点。RNase R和放线菌素D验证了circUtrnR的稳定性。RT-qPCR发现circUtrn在小鼠心脏中含量非常丰富。RNA 荧光原位杂交实验表明circUtrn 主要定位于细胞质（图1 D-I）。

另外，在游泳训练小鼠的心肌成纤维细胞中，circUtrn的表达水平没有变化，表明circUtrn可能在心肌细胞中发挥特异性作用（图1J）。为了验证与人类的相关性，作者检测了篮球运动员在急性和长期运动训练期间的血清中circUtrn的表达。与对照组相比，长期运动的运动员的血清circUtrn水平显著升高，表明血清circUtrn水平与耐力训练呈正相关（图1K）。综上所述，circUtrn是一种保守的circRNA，在心肌组织中高表达，定位于细胞质，运动训练后在心肌细胞中特异性上调。

图1 游泳运动训练后成年小鼠心肌细胞中circRNA表达的鉴定

circUtrn调控hESC-CMs的肥大和细胞凋亡

为了研究circUtrn在心肌细胞中的作用，作者首先构建了circUtrn过表达（circUtrn OE）和敲低（sh-circUtrn）模型，在circUtrn OE后，H9人胚胎干细胞诱导的心肌细胞（hESC-CMs）的细胞大小在基础水平上增加，而sh-circUtrn则相反（图2C）。此外，circUtrn OE增强了hESC-CMs的DNA复制和细胞周期活性（Ki67染色，pHH3染色），而sh-circUtrn则降低了其活性（图2C-D）。TUNEL染色表明，circUtrn OE可抑制OGD/R诱导的hESC-CMs细胞凋亡，sh-circUtrn和OGD/R处理促进hESC-CMs凋亡（图2E）。同时，Bax是促凋亡调节因子，而Bcl2是抗凋亡调节因子。Bax/Bcl2也证实了circUtrn对心肌细胞凋亡的调控作用（图2F）。综上所述，circUtrn调节心肌细胞的生长和存活。

图2 circUtrn调控hESC-CMs的肥大和细胞凋亡

circUtrn是运动诱导的生理性心脏肥大所必需的

为了进一步探索运动诱导的生理性心肌肥大过程中心脏circUtrn升高的体内影响，作者构建了腺相关病毒血清型9（AAV9）介导的sh-circUtrn（AAV9-sh-circUtrn）和对照（AAV9-shScramble），随后通过尾静脉注射到成年小鼠体内。AAV9给药一周后，小鼠被随机分配到游泳训练组或久坐组（对照组）。游泳训练的持续时间为4周，以诱导生理性心肌肥厚（图3A）。经AAV9-sh-circUtrn处理后，小鼠心脏中circUtrn的表达受到抑制（图3B）。通过对心脏形态、心脏重量（HW）和心脏重量/胫骨长度（HW/TL）的测量，circUtrn敲低抑制了心肌肥厚的发展（图3C）。接下来，小麦胚芽凝集素（WGA）染色发现与接受AAV9-shScramble治疗的小鼠相比，下调circUtrn降低了心肌细胞的横截面积（图3D）。此外，通过α-actinin与EdU、Ki67和pHH3共免疫荧光染色，表明AAV9-sh-circUtrn处理的训练小鼠心肌细胞显示较低的增殖标志物表达水平（图3E）。综上所述，circUtrn是运动诱导的生理性心肌肥大发展所必需的。

图3 circUtrn是运动诱导的生理性心脏肥大所必需的

circUtrn过表达可防止缺血再灌注诱导的病理心脏重构

为了探讨circUtrn升高对心肌细胞凋亡的保护作用是否也存在于动物体内，通过RT-qPCR表明，急性心肌缺血再灌注（I/R）损伤心脏中circUtrn表达下调。随后，作者构建了circUtrn过表达AAV9（AAV9-OE-circUtrn），并通过尾静脉注射给成年小鼠，七天后进行I/R处理。circUtrn（TTC）染色证明，在急性I/R损伤的心脏中，梗死面积显著缩小。此外，TUNEL染色和Western-blot分析（Bax/Bcl2）显示，circUtrn过表达抑制急性I/R损伤诱导的细胞凋亡（图S7A-F）。综上所述，circUtrn过表达可通过降低心肌梗死面积和细胞凋亡来减少急性I/R损伤。

为了进一步探究circUtrn过表达对I/R诱导的病理性心脏重构的有益影响。作者在小鼠心脏中过表达了 circUtrn。注射AAV9 七天后，分别进行了I/R和sham手术（图4A）。I/R术后3周的心脏超声心动图显示，与对照组小鼠相比，过表达circUtrn的小鼠心脏的左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（FS）更高（图4C）。WGA染色显示，心肌细胞间因不良的 I/R 重构而出现的更大的间质空间被 AAV9-OE-circUtrn 给药所抑制（图4D）。此外，circUtrn 的过表达还能减轻 I/R 重构诱导的心脏纤维化，且纤维化相关基因和肥大基因的表达减少（图4 E-F）。综上所述，circUtrn过表达可改善I/R重构诱导的心功能障碍，并减轻心脏纤维化。

图4 circUtrn过表达可防止缺血再灌注诱导的病理心脏重构

circUtrn降低可抑制运动对缺血再灌注诱导的病理性心脏重构的保护作用

运动对心脏功能的好处已经被公认。因此，作者进一步确定circUtrn是否对运动对缺血再灌注诱导的病理性心脏重构的保护作用。通过尾静脉注射给予AAV9-sh-circUtrn或AAV9-sh Scramble治疗7天后，成年小鼠接受4周的游泳训练（与4周的久坐对照）以诱导生理性心肌肥大。然后，小鼠被随机分配到I/R手术和sham手术。在I/R重构后3周，与久坐对照组相比，游泳训练小鼠的心脏功能显著改善，而AAV9-sh-circUtrn处理的小鼠心脏功能下降（图5B）。与 AAV9-shScramble 处理的小鼠相比，AAV9-sh-circUtrn 处理的对照组小鼠在I/R重构3周后，心脏功能出现恶化，这表明circUtrn在应激刺激下具有额外的保护作用（图5B）。sham手术组游泳运动结束后，游泳运动对circUtrn的上调影响在sham手术3周后恢复到基线，而与久坐对照组心脏相比，游泳运动组心脏的 RNA 水平在 I/R 3周后保持不变（图5C和补充图 S8）。Masson三色染色表明接受运动训练的小鼠的心脏显示出心脏纤维化减少，而AAV9-sh-circUtrn减弱了这些保护作用，久坐对照组的AAV9-sh-circUtrn治疗的小鼠在I/R重构期间出现了严重的心脏纤维化（图5D）。此外，与久坐不动的对照组小鼠相比，运动训练小鼠的纤维化基因的表达降低，而AAV9-sh-circUtrn治疗部分降低了这些作用（图5E）。综上所述，在缺血再灌注损伤的体内模型中，运动诱导的circUtrn升高具备对病理心脏重构的保护作用。

图5 circUtrn敲低可抑制运动对缺血再灌注诱导的病理心脏重构的保护作用

circUtrn与PP5相互作用，并以泛素-蛋白酶体依赖的方式促进PP5的降解，从而激活MAPK/ERK信号通路

作者接着研究了 circUtrn 参与心肌细胞信号转导的调控机制。作者使用生物素标记的线性化的环状链和反义链从小鼠心脏裂解液中提取蛋白质，以拉下结合蛋白。随后质谱检测、Western blot发现circUtrn与丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶5（PP5）结合（图6A-B）。同样在AC16心肌细胞中验证了circUtrn与PP5存在相互作用（图6D）。此外，通过 RIP分析，证实了circUtrn与PP5的结合（图6E）。综上所述，PP5可以在心肌细胞中特异性地结合circUtrn。

在心脏中，PP5在衰竭的心脏中增加，在游泳训练诱导的心肌肥大小鼠中，PP5的表达显著降低。相反，在经历I/R重构（I/R 3w）的小鼠中，其表达被升高（补充图S10B）。另外，circUtrn在小鼠心脏和hESC-CMs的蛋白水平上负调控PP5的表达，而在PP5 mRNA水平上没有显著差异（图6F）。

PP5可使Raf1去磷酸化，从而调节MAPK/ERK信号通路，而ERK1/2的激活可抑制心肌细胞凋亡。在hESC-CMs和小鼠心脏中，过表达circUtrn导致PP5水平下降，从而导致Raf1和ERK1/2的磷酸化水平显著增加（图6G）。接下来，通过使用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理过表达或正常的AC16心肌细胞，并确定PP5降解的时间过程。结果表明，过表达circUtrn显著降低了PP5的稳定性（图6H）。

在肾癌中，PP5可被连接酶泛素化，随后被蛋白酶体降解。所以作者接着研究了泛素蛋白酶体途径是否参与了circUtrn介导的PP5在心肌细胞降解。PP5免疫共沉淀实验表明，在过表达circUtrn的心肌细胞中，泛素化的PP5增加（图6I）。而用蛋白酶体抑制剂MG132处理后，能够减弱了circUtrn过表达介导的PP5泛素化降解（图6J）。此外，通过生物素标记的体外转录circUtrn片段，RNA pulldown进一步证实了预测的相互作用（图6K）。同时，RIP实验表明只有完整的PP5结构能够充分结合circUtrn，而其他突变体结构不能免疫沉淀circUtrn。综上所述，circUtrn在心肌细胞中与PP5结合，并以蛋白酶体依赖的方式促进 PP5的降解，从而激活MAPK/ERK信号通路。

图6 circUtrn与PP5相互作用，并以泛素-1蛋白酶体依赖的方式促进PP5的降解，从而激活MAPK/ERK信号通路

过表达PP5逆转了circUtrn对hESC-CMs的调控作用

作者进一步探讨了PP5是否参与了circUtrn在hESC-CMs中的调控作用。在基础水平上，PP5过表达导致心肌细胞体积减小，DNA复制（EdU）和细胞周期活性相关标志物（Ki67、pHH3）的表达减少（图7A-7B）。重要的是，circUtrn对hESC-CMs的促肥大和促细胞周期进入效应被PP5过表达所逆转（图7A-7B）。此外，过表达PP5加剧了OGD/R诱导的hESC-CMs细胞凋亡，降低了过表达circUtrn对心肌细胞凋亡的保护作用（图7C）。综上所述，PP5作用于circUtrn的下游，介导其调节hESC-CMs的生长和凋亡。

图7 过表达PP5逆转了circUtrn对hESC-CMs的调控作用

总结：

本研究确定了一个保守的circRNA-circUtrn，它在运动的小鼠心肌细胞中显著增加。在体外，circUtrn 的过表达可促进心肌细胞肥大，并通过结合和调节 PP5 缓解 OGD/R 诱导的细胞凋亡。在体内，运动诱导的circUtrn的增加对于 I/R重构环境下运动的保护作用至关重要。在小鼠心脏中强制过表达circUtrn可减少急性心肌 I/R损伤，并防止I/R重构。

图8 circUtrn在体内外的功能作用机制

原文链接：

10.1093/cvr/cvad161

Pharmacol Ther丨杨晓峰教授综述circRNA在心血管和代谢性疾病中的研究进展

admin — Fri, 07 Apr 2023 05:59:52 +0000

引言

环状RNA(circRNA)作为真核细胞中存在的内源性非编码RNA，具有广泛的表达水平。circRNA具有共价闭环结构，没有5’−3’，极性或多腺苷化的尾巴，比线性RNA更稳定。大多数circRNA，包括外显子circRNA，存在于细胞质中，而保留内含子的circRNA位于细胞核内。circRNA在物种间高度保守，具有microRNA反应元件(MRE)，使它们能够与miRNAs相互作用并调节基因表达。circRNA可以在转录和转录后调节中发挥作用。然而，关于circRNA在心血管和代谢性疾病相关的血管炎症中的作用知之甚少。而鉴于以上circRNA在不同疾病中的重要作用，circRNA的新疗法的开发可能有助于减轻与心血管和代谢性疾病相关的血管炎症。

2022年4月，美国心血管研究中心杨晓峰教授在Pharmacol Ther上发表了题为Circular RNAs are a novel type of non-coding RNAs in ROS regulation, cardiovascular metabolic inflammations and cancers的综述。

一、核糖核酸介绍

细胞核糖核酸(RNA)可分为两类：编码和非编码RNA。非编码RNA(ncRNAs)是从DNA转录而来的功能性RNA，但不能翻译成蛋白质。这些ncRNAs根据其大小可分为两类，大于200个核苷酸的ncRNAs被归类为长非编码RNA(Long Non-Coding RNAs，LncRNAs)，小于200个核苷酸的ncRNAs被归类为小ncRNAs。小的ncRNAs还可以进一步分为：

microRNAs(miRNAs)

小干扰RNAs(siRNAs)

小核RNAs(snRNAs)

小核仁RNAs(snoRNAs)

piwi相互作用RNAs(piRNAs)

转移RNAs(tRNAs)

核糖体RNAs(rRNAs)

图1 核糖核酸的分类

二、circRNA生物发生

circRNA生物发生为传统的mRNAs生成增加了一个修饰步骤。前体信使核糖核酸(pre-mRNA)的剪接是由典型的剪接体机制催化的，以去除转录本中的内含子并连接外显子，从而形成具有5’−3’极性的线性信使核糖核酸。外显子circRNAs通常位于细胞质中，但内含子和外显子circRNAs留在细胞核中。

图2 circRNA的生成机制

circRNA形成模型

到目前为止，已经提出了四种不同的circRNA生物发生的假设模型包括：(I)内含子配对驱动的环化；(Ii)RNA结合蛋白(RBP)驱动的环化；(Iii)外显子跳过；以及(Iv)内含子套索环化。

图3 circRNA的形成模型

三、circRNA的分类

在circRNA中主要分为三个主要亚类。

(A)外显子circRNAs（ecircRNAs）

只包含外显子(s)（通常小于5个），是circRNA类中最重要的一类。ecircRNA具有细胞质位置，可能调节microRNA和蛋白的功能。

(B)外显子-内含子circRNAs（EIciRNAs）

由外显子和保留的内含子组成。EIciRNAs具有核定位，并已被发现能够顺式调控基因转录，也可能是反式调控基因转录。

(C)内含子circRNAs（ciRNAs）

来源于内含子套索，积累在细胞核中，以顺式调控基因转录。

图4 circRNA的分类

四、circRNA的生物学功能和机制

近些年来，circRNA的生物学功能已成为科学研究的热点。越来越多的证据表明，除了作为miRNA海绵外，circRNA的其他几个角色也被提出——蛋白海绵、诱饵、支架和招募者。除此之外，通过加强与RNA聚合酶II的结合，位于细胞核的circRNA可以调节其宿主基因的转录，并调节选择性剪接、转录和翻译。

1、circRNA可以作为miRNA海绵

●大多数circRNA位于细胞质中，表明它们参与了转录后调控——作为miRNA海绵或竞争性内源RNA(ceRNAs)，与miRNAs竞争结合mRNA靶标，从而间接调节mRNA翻译。miRNAs与mRNAs的3′-非翻译区结合可导致mRNA降解或抑制蛋白质翻译。

2、circRNA可作为RNA结合蛋白(RBP)海绵

●circRNA可以作为蛋白质海绵，为特异性RBP提供结合位点，通过竞争性抑制来隔离和抑制蛋白质的生物活性。这一过程可能会间接影响其靶标mRNAs的命运。在最近的一项研究中，TTP海绵circRNA被发现在小鼠模型中增强全身炎症。CircFoxo3可以与蛋白质相互作用，抑制细胞周期进程，调节心脏衰老。

3、circRNA可以调节翻译和选择性剪接

●circRNA可以结合开放阅读框架(ORF)被翻译成蛋白质片段，这需要IRES的介导作用亦或是m6A的修饰。circRNA能够翻译的原因也可能是细胞对环境应激源的反应，刺激circRNA翻译蛋白。此外，一些circRNA可以调节其相关线性mRNAs的翻译。

4、circRNA作为基因表达调控因子

●circRNA和线性RNA在生物合成上相互竞争，circRNA可以调节线性RNA的表达。某些circRNA，如ciRNAs和EIciRNAs，通过与基因启动子区域的U1 Snrpn和RNA聚合酶II结合，促进亲本基因的转录。

5、circRNA的降解和消除

●circRNA具有高度的稳定性，半衰期长；因为它们的环状结构，使得它们可抵抗RNase核酸外切酶。目前，对于circRNA如何在体内降解的机制知之甚少。已有研究报道，RNase L可降解circRNA。亦有研究表明RNA修饰、N6甲基腺苷(m6A)以及聚(I：C)刺激可介导内切核酸酶RNase L的激活，并最终导致mRNAs和circRNA的降解。

图5 circRNA功能和降解的示意

五、研究circRNA的方法

自从circRNA被发现以来，已经开发了各种生化工具来检测和验证它们的存在、定位、生物发生、生物学功能、疾病含义、相互作用的分子和治疗潜力。还开发了生物信息学工具和统计方法来量化circRNA的表达水平，并高置信度地识别新的circRNA。高通量circRNA测序(CIRC-SEQ)分析、微阵列高通量分析、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、数字液滴聚合酶链式反应(DdPCR)、Northern印迹分析和RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)结合高分辨率显微镜是用于研究circRNA的一些技术。还开发了几个在线circRNA资源和公共数据库，以提供有关circRNA的关键生物信息学知识。目前正在研究circRNA对各种疾病的潜在治疗用途，并正在开发用于circRNA操作的分子工具。为了研究circRNA，已经发展了circRNA过表达(功能放大)和敲低(功能丧失)方法，例如使用包含circRNA序列并由病毒载体系统递送的表达载体、非病毒策略、小干扰RNA(siRNA)和小发夹状RNA(shRNA)。

六、外泌体circRNA

circRNA高度稳定，不易降解，如果不加以控制，它们可以在细胞内积累。外泌体是大多数细胞类型分泌的膜结合囊泡，circRNA可以被包含其中，在细胞间发挥通讯和信号转导作用。2015年，Li等人首次报道了外泌体中含有丰富的circRNA。这些circRNA在RNase R处理后仍然在血清中稳定存在。另有研究表示，许多外泌体circRNA可以被释放到细胞外并在血液中检测到，被用作癌症的潜在生物标志物。

图6 exo-circRNA的产生

七、circRNA作为潜在的诊断生物标志物

生物标记物在疾病的早期检测中是有用的，而circRNA由于其丰富性、稳定性、组织特异性表达和存在于外泌体中而有望成为疾病生物标记物。

一些circRNA如hSA_CIRC_002059和hSA_CIRC_104916在胃癌组织中表达下调，可作为潜在的诊断生物标志物。

八、circRNA对血管炎症的调节作用

内皮功能障碍和血管炎症与多种病理过程有关，如炎症、缺血性心血管疾病以及代谢紊乱。内皮细胞是一种条件性先天免疫细胞，具有危险/病原体相关分子模式的受体，使它们能够感知各种潮湿和条件性潮湿。靶向血管内皮细胞功能障碍和炎症在预防和治疗血管并发症方面具有巨大的治疗潜力。一些证据表明，circRNA在不同的心血管疾病中都有表达，通常与内皮功能障碍、血管平滑肌细胞增殖和迁移以及血管炎症有关。circRNA通过miRNA海绵作用参与心血管疾病，从而调节其靶基因以维持内环境平衡。其中一些circRNA(促炎性circRNA)促进内皮功能障碍、血管炎症和心血管疾病，而另一些circRNA则有抑制作用。

图7 已报道的促血管炎症和心血管疾病circRNA的总结

“结论

circRNA是RNA研究的一个新的重要领域。它们是一种多样性、稳定性和保守型的RNA，具有调节作用，但其确切的功能和机制尚不完全清楚。circRNA已被证明作为miRNA和RBP海绵，调节转录和基因表达，并具有潜在的治疗用途。最近的circRNA数据库提供了关于组织特异性表达谱和调控网络的信息。这些见解表明，调节特定组织和细胞中circRNA的表达可能有助于减少与心血管和代谢性疾病相关的内皮功能障碍和炎症。

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