circRNA与mRNA互作

韩国科学技术院Yoon Ki Kim研究团队揭示了circRNA可通过与mRNA的3′ UTR相互作用，将其携带的外显子连接复合体（EJC）定位在mRNA的3′ UTR附近，从而靶向调控无义介导的mRNA降解(NMD)机制。人工设计的circRNA，可靶向下调mRNA水平，为circRNA在基因沉默和疾病治疗中的潜在应用开辟了广阔前景。^[11]
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肿瘤疫苗类型包括肽/蛋白、树突状细胞(DC)和核酸(包括DNA和RNA疫苗)。其中RNA疫苗可在细胞质内快速表达抗原，从而导致强大的免疫激活，还可避免基因组整合和T细胞耐受性相关风险。加之circRNA的独特优势，可成为极具前景的肿瘤疫苗载体。

斯坦福大学的张元豪和Wender研究团队利用circRNA编码卵清蛋白 (OVA)^[27]，多伦多大学李博文团队利用circRNA编码IL-12^[28]、福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙/赵必星团队利用circRNA编码新抗原PTPN2多肽片段^[29]，结果发现这些circRNA肿瘤疫苗均可在模型体内诱导强烈的抗肿瘤免疫反应，且能强效、安全、稳定抑制肿瘤生长，甚至清除肿瘤，效果显著优于线性mRNA，且无明显副作用。

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中山大学附属第一医院张弩团队联合吉赛生物团队开发表达lncRNA编码肽肿瘤抗原的疫苗circH19-vac，可触发针对胶质母细胞瘤的强效细胞毒性T细胞反应并抑制肿瘤生长。^[30]

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circRNA还有望成为优越的肿瘤抗原载体，开发有效的DC疫苗。吉林大学张海红团队开发编码肿瘤抗原FAPα和survivin的circRNA DC疫苗，可显著抑制肿瘤生长，与吉西他滨药物进行联合治疗，显著延长了胰腺癌小鼠的存活率。^[31]

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图4 circRNA疫苗激活免疫反应。^[32]

CAR-T疗法

SARS-CoV-2属于冠状病毒科的β冠状病毒属，由包膜和S蛋白亚基介导与宿主细胞融合，将病毒基因组释放到细胞质。SARS-CoV-2 的 S 蛋白、S1 亚基或 RBD 抗原可以诱导 B 细胞和 T 细胞反应，产生针对 SARS-CoV-2 的高效中和抗体。疫苗接种是遏制COVID-19的有效途径，传统的灭活病毒等疫苗已被用于疫苗的开发。针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗也取得了快速的发展。mRNA疫苗包含由5’帽、非翻译区（UTR）、抗原编码区和3’多聚体尾组成的线性单链RNA，并通过脂质纳米粒（LNP）输送到体内。递送介质的不稳定性；mRNA在体内较短的半衰期；免疫原性；储存和运输成本等因素制约着mRNA疫苗的发展。

与mRNA相比，环状RNA高度稳定，共价闭合环状结构保护其不受核酸外切酶的降解。环状RNA可通过非帽依赖的方式翻译蛋白质，为开发针对新冠变株高效的疫苗提供了可能。

继2021年3月和2022年1月发布在BioRxiv预印本的环状RNA疫苗相关研究成果[1,2]。2022年3月31日，北京大学魏文胜团队在Cell在线发表论文Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants，该研究报告了一种环状RNA疫苗，通过表达S蛋白的三聚体RBD，诱导有效的中和抗体和T细胞免疫反应，在小鼠和恒河猴中提供针对变种SARS-CoV-2的强大保护。

如图1A所示，作者利用I型内含子核酶生成具有编码SARS-CoV-2-RBD抗原潜能的环状RNA——circRNA-RBD。为了提高RBD抗原的免疫原性，作者将噬菌体T4纤溶蛋白的三聚基序融合到RBD的C末端。同时，作者也尝试使用T4 RNA连接酶体外合成环状RNA，产生高浓度和高丰度的circRNA-RBD抗原。

作者将纯化的circRNA-RBD转染人和小鼠细胞，使用Western blot检测到人类和小鼠细胞的上清液中含有丰富的RBD抗原。如图1H所示，为了探索制造环状RNA疫苗的可能性，作者使用LNP递送circRNA-RBD至BALB/c，并在小鼠脾脏发生了强烈的免疫应答。SARS-CoV-2 circRNA^RBD疫苗可诱导BALB/c产生高水平中和抗体的持续体液免疫应答。

图1. 环状RNA疫苗对SARS-CoV-2小鼠的免疫原性及保护作用

随后，作者在恒河猴中验证了环状RNA疫苗的效果。环状RNA疫苗在恒河猴体内诱导了有效的中和抗体和Th1偏向性免疫反应，接种环状RNA疫苗的恒河猴暴露于病毒环境，而在肺部组织仅检测到轻微的验证反应，基本检测不到病毒RNA，对恒河猴产生有效的保护。未接种疫苗的猴子则在肺部检测到大量病毒的存在。

图2.CircRNA疫苗对恒河猴SARS-CoV-2感染的免疫原性和保护作用

作者还发现，针对Delta毒株的疫苗具有广谱性，可抵抗Omicron，未来的疫苗研究应聚焦Delta毒株；针对Omicron毒株的疫苗保护力狭窄，不可抵抗Delta毒株；针对原始毒株的疫苗，加强针使用Delta疫苗，保护力可以覆盖Delta和Omicron突变株。

与 1mΨ（假尿苷，提高活性，降低免疫） 修饰的mRNA疫苗相比，环状RNA疫苗能够实现更高和更持久的抗原表达，并引发更高比例的中和抗体和明显的 Th1 偏态免疫反应。

面对COVID-19带来的全球健康危机，以及SAS-CoV-2变异株，尤其是Delta和Omicron变异毒株带来的疫情的反复。本研究针对变异毒株，建立了一种可以产生有效中和抗体和T细胞免疫应答的环状RNA疫苗接种策略。并在许多方面检测到环状RNA疫苗优于mRNA疫苗对应物的特征。同时，作者也提到体外制备环状RNA的体内免疫原性，及生物安全性的问题需要进一步的临床实验进行验证。

图文摘要

原文链接：https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S0092-8674%2822%2900394-4

参考文献：

[1]. Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants Liang Qu, Zongyi Yi, Yong Shen, Yiyuan Xu, Zeguang Wu, Huixian Tang, Xia Xiao, Xiaojing Dong, Li Guo, Ayijiang Yisimayi, Yunlong Cao, Zhuo Zhou, Jianwei Wang, Xiaoliang Sunney Xie, Wensheng Wei bioRxiv 2021.03.16.435594; doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.16.435594

[2]. Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants Liang Qu, Zongyi Yi, Yong Shen, Liangru Lin, Feng Chen, Yiyuan Xu, Zeguang Wu, Huixian Tang, Xiaoxue Zhang, Feng Tian, Chunhui Wang, Xia Xiao, Xiaojing Dong, Li Guo, Shuaiyao Lu, Chengyun Yang, Cong Tang, Yun Yang, Wenhai Yu, Junbin Wang, Yanan Zhou, Qing Huang, Ayijiang Yisimayi, Yunlong Cao, Youchun Wang, Zhuo Zhou, Xiaozhong Peng, Jianwei Wang, Xiaoliang Sunney Xie, Wensheng Wei bioRxiv 2021.03.16.435594; doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.16.435594

胞外囊泡运送circSCMH1，可用于啮齿动物和非人灵长类动物缺血性中风的功能恢复（[1]）。

缺血性中风是一种常见的神经系统疾病，也是导致永久性残疾的重要原因。到目前为止，关于中风恢复和治疗的药物很少被报道，中风药物的研发仍然是一个迫切的研究领域，可以使大量患者受益。本文作者提出了一种潜在的核苷酸药物传递技术，即胞外囊泡运送circSCMH1。circSCMH1可与转录因子MeCP2结合，降低它对靶基因转录的抑制，从而促进啮齿动物和非人灵长类动物缺血性中风模型的功能恢复。

急性缺血性中风（AIS）患者和中风小鼠模型中circSCMH1表达降低

使用circRNA芯片技术检测AIS患者血浆中circRNA的表达差异，鉴定出20个差异表达的circRNA，它们在人和鼠中具有高度同源性，并且差异倍数>2。在AIS患者血浆中使用qPCR对结果进行验证，发现仅仅有12个circRNA被检测到。其中，circSCMH1下调的水平与芯片结果相似，选择它做进一步研究。在光诱导血栓（PT）中风后的第6-7天，检测到缺血引起小鼠梗死周围皮层和血浆中circSCMH1水平显着降低。

ROC分析circSCMH1对AIS的诊断作用，circSCMH1的AUC值可达0.7896，有91.72％的敏感性和64.83％的特异性。作者进一步发现circSCMH1水平与不同血管危险因素相关，例如吸烟史、既往短暂性脑缺血发作（TIA）、中风和心肌梗死（MI）。此外，根据急性中风治疗试验(TOAST)标准，检测到在小血管疾病、大血管疾病和心脏栓塞患者中，circSCMH1的表达水平均降低。

下一步检测circSCMH1是否与中风的预后相关。Mann-Whitney U检验显示，circSCMH1水平在预后较好的患者中更高。使用ROC检测circSCMH1对AIS的预后作用，AUC是0.6864,有68.85%的敏感度和70.24%的特异度。并且在排除年龄、高血压和既往TIA、中风和MI等血管危险因素后，circSCMH1仍然可以作为预后指标。除此之外，发现AIS患者入院治疗7天后，circSCMH1水平显著升高。以上结果表明中风导致circSCMH1水平下降，并且它具有作为AIS的诊断分子和预后分子的潜力。

图1 circSCMH1在AIS患者中下调

构建RVG-EV靶向大脑损伤区域

细胞外囊泡（EV）是由细胞释放的直径为30到150 nm的脂膜囊泡，可以穿过血脑屏障（BBB），能够运输蛋白质、脂质和核苷酸。一项突破性的研究表明，狂犬病毒糖蛋白(RVG)可以通过融合蛋白溶酶体相关膜糖蛋白2b(Lamp2b)-RVG，定位于EV的表面，实现脑特异性靶向的潜力。作者利用同样的设计，制备靶向大脑的RVG-circSCMH1-EV，探讨circSCMH1在中风病理过程中的作用。用编码GNSTM-RVG-Lamp2b-HA和circSCMH1的质粒共转染HEK293T细胞，然后进行EV纯化。梯度离心法从培养细胞的上清液中分离出EV，使用纳米颗粒分析、电镜、qPRC和Western blot等方法对分离的EV进行了验证，结果表明RVG-circSCMH1-EV构建成功。

检测注射EV是否可以将circSCMH1运送至大脑，用DiI标记未修饰的EV（circSCMH1-EV）和修饰的EV（RVG-Vector-EV和RVG-circSCMH1-EV）。将EV悬浮于PBS中，通过尾静脉注射到小鼠体内，在转染6小时后收集脑、肺、心、脾、肾和肝组织。qPCR显示，与未修饰的circSCMH1-EV相比，RVG-circSCMH1-EV组大脑中circSCMH1的表达更高，表明RVG-EV成功地靶向了脑组织。在大脑中，红色的DiI颗粒大部分位于小簇中，可见于神经元的细胞质内或附着在神经元的细胞膜上，在星形胶质细胞和小胶质细胞中也检测到标记的EV。

图2 构建RVG-EV来靶向大脑损伤区域

RVG-EV递送circSCHM1促进PT小鼠的功能恢复

接下来，作者检测RVG-circSCMH1-EV对PT小鼠功能恢复的影响。使用PT诱导雄性小鼠中风，24小时后静脉注射RVG-circSCMH1-EV。在PT中风后的第2天进行Nissl染色，在第4-28天进行行为测试。在网格行走测试中，与对照组相比，RVG-circSCMH1-EV组的动物在PT处理后第4、7、14、21和28天表现更好并减少了脚部缺陷。黏附物能力测试和潜伏期移动试验得到了相同的治疗结果。得出结论，RVG-circSCMH1-EVS可以促进中风后的运动恢复，起到治疗中风的作用。然而，Nissl染色表明RVG-circSCMH1-EV组和对照组的梗死面积并没有显著差异。此外，RVG-circSCMH1-EV对另一种中风模型-大脑中动脉远端闭塞(DMCAO)模型也具有同样的运动恢复作用。最后，作者排除了circSCMH1给药引起全身毒性和免疫反应的可能性，表示RVG-circSCMH1-EV具有临床应用的潜力。

图3 RVG-EV递送circSCHM1促进PT小鼠的功能恢复

体内和体外过表达circSCMH1均可恢复脑神经元的可塑性

接下来，作者研究circSCMH1促进中风后功能恢复的细胞机制。用流式细胞仪对未中风组小鼠和PT组小鼠的神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞进行分类。原位杂交显示，circSCMH1集中在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中。PT处理后显著减少了小鼠梗死周围皮质的棘突数目、轴突分支和树突长度，以及神经元交叉点的数目，并且这些表型都被RVG-circSCMH1-EV处理所改善。此外，RVG-circSCMH1-EV处理显著改善了PT小鼠突触相关蛋白PSD95和突触素水平的降低。

与体内的研究结果相似，氧糖剥夺(OGO)导致皮层神经元树突棘密度显著降低，这种减少可以通过转导circSCMH1慢病毒得到改善。在OGD处理的神经元中观察到MAP2免疫反应性的显著丧失和神经元突起长度的缩短，这些效应可以通过circSCMH1慢病毒的转导而得到改善。

图4 circSCMH1过表达会恢复在体内和体外脑神经元的可塑性

circSCMH1降低胶质细胞活化和外周免疫细胞浸润

下一步，作者试图检测circSCMH1是否改变了梗死周围皮层的局部胶质细胞活化和炎性激活。与对照组相比，RVG-circSCMH1-EV处理显著降低了PT小鼠梗死前区域的TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6水平。它还显著降低了PT小鼠梗死周围皮层的星形胶质细胞和小胶质细胞的反应性。在体外，用circSCMH1慢病毒转导细胞可显着降低OGD诱导的星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，而敲低circSCMH1会增加星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。

由于星形胶质细胞和小胶质细胞的不同表型与细胞毒性或神经保护相关，接下来探索circSCMH1对星形胶质细胞和小胶质细胞阶段特异性转换的作用。RVG-circSCMH1-EV处理导致PT小鼠梗死灶中A1星形胶质细胞特异性转录物（Ligp1、Gbp2、Psmb8和Srgn）显着下调，A2星形胶质细胞特异性转录物（Tgm1，Ptx3和Tm4sf1）显着上调。此外，RVG-circSCMH1-EV处理会使细胞偏向M2a和M2c表型，M1型细胞比例减少。

作者还检测了RVG-circSCMH1-EV是否改变外周细胞浸润，由于CD45+群体包含浸润的免疫细胞，作者从梗死周围皮层收集了这些细胞，并使用流式细胞术根据CD45信号进行门控。进行下一步的分析，以量化淋巴样（CD4 +和CD8 +）T细胞、B细胞和骨髓细胞群体。RVG-circSCMH1-EV处理显著降低了淋巴样T细胞、B220B⁺细胞和Ly6G-Ly6C^1o巨噬细胞/单核细胞的频率，而Ly6G-Ly6C^hi巨噬细胞/单核细胞和Ly6G⁺中性粒细胞并没有改变。总之，这些发现表明，RVG-circSCMH1-EV抑制了中风后免疫细胞向同侧大脑半球的浸润。

图5 circSCMH1减少胶质细胞活化和外周免疫细胞浸润

circSCMH1结合MeCP2

为了确定参与神经元可塑性的分子机制，对circSCMH1过表达的原代皮层神经元进行了转录组分析和蛋白质组筛选。作者在RNA-seq中发现了4010个差异表达的基因。串联质谱显示，circSCMH1在胞浆中的异位表达导致73种蛋白质在细胞核中表达上调，123种蛋白质在细胞核中表达下调。在这些蛋白质中，使用TRRUST数据库进行分析，鉴定了两个上调的蛋白(PHF2和SIN3A)和三个下调的蛋白(MeCP2、TRP53BP1和MAZ)，它们可以调节15个差异表达(DE)的基因，其中9个已被鉴定为MeCP2的靶基因。

接下来，通过qPCR验证了15个DE基因的表达差异，并通过实验证实了9个MeCP2靶基因中的4个(mobP、igFBP3、Fxyd1和Prodh)确实是在circSCMH1过表达的神经元中存在差异表达。此外，TRP53BP1靶基因brcal、SIN3A靶基因Rest和PHF2靶基因Sox9在circSCMH1过表达神经元中也显著降低，但MAZ靶基因Htr1a未见明显降低。然后，采用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)方法鉴定circSCMH1结合蛋白。在这5种蛋白中，circSCMH1与MeCP2有丰富的结合。这种结合力和已知的大量靶基因为进一步研究circSCMH1和MeCP2之间的功能关系奠定了基础。

接下来，作者使用catRAPID算法分析circSCMH1与MeCP2的相互作用，预测到MeCP2的三个区域与circSCMH1具有高相互作用能力：MeCP2的残基26-76、236-287和403-453。通过RIP分析确定circSCMH1和MeCP2的结合需要残基26-76区域。此外，构建circSCMH1突变质粒证实了circSCMH1 426-485序列对于互作是重要的。为了确定circSCMH1和MeCP2的相互作用是否影响MeCP2的分布，进行了免疫荧光染色和western blot，发现细胞质中circSCMH1的异位表达增加了原代皮层神经元胞质中MeCP2的水平，并降低其在细胞核的水平。

图6 circSCMH1结合MeCP2

circSCMH1促进非人灵长类动物中风后的运动功能恢复

为了进一步探索circSCMH1的功效，作者在非人灵长类动物中建立了PT中风模型，在PT后的第24到48小时注射RVG-circSCMH1-EV，来测试circSCMH1促进运动恢复的作用，恒河猴接受垂直插槽测试、Klüver棋盘测试和旋转Brinkman棋盘测试，来评估PT后第4、7、14、21和28天的手指灵活性，尤其是手指的抓握能力。在PT处理之前，所有猴子都能够平稳地完成上述三个任务。在垂直槽测试中，RVG-circSCMH1-EV实验组和RVG-Vector-EV对照组的猴子在完成时间和成功率上没有显着差异。在Klüver棋盘测试中，RVG-circSCMH1-EV组大大缩短了完成时间，但是，接受这种治疗的猴子仅在PT后第7天和第28天才显示出成功率的明显升高。旋转Brinkman棋盘测试是三项中最难的实验，与对照相比，RVG-circSCMH1-EV组显着改善了猴子的表现，缩短了完成的时间，并且在逆时针和顺时针方向上以12秒/轮的旋转速度增加了成功率。以上实验表明circSCMH1会提高猴子的抓力和手指灵活性。此外，与对照组相比，在PT后第21和28天，RVG-circSCMH1-EV组的神经功能损伤评分（NDS）明显降低。

图7 circSCMH1促进非人类灵长类动物中风后的运动功能恢复

参考文献

[1] Yang L, Han B, Zhang Z, et al. Extracellular Vesicle-Mediated Delivery of CircSCMH1 Promotes Functional Recovery in Rodent and Nonhuman Primate Ischemic Stroke Models. Circulation. 2020; doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.120.045765

也许这只是把酒言欢之际的一种说辞，但也可能是一种疾病。社交或人际关系对人的心理生理健康影响极大，长期孤独会显著地提高了自杀的风险^[1]。然而，有一群人却从幼儿时期就“与世隔离”。

孤独症或自闭症在医学中被称为自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）是一种多见于儿童的神经发育障碍性疾病，病症包括语言障碍、有限的社交与兴趣以及固执的行为模式。

已有研究者尝试从不同的角度对 ASD 发生发展的分子学机制进行了解读，包括：

• ASD 被发现具有高度的遗传异质性
• 已发现有数百个基因的遗传变异与 ASD 致病相关，然而每一个基因的致病效果占比很小
• 环境与基因的交互与 ASD 的进展密切相关
• 一些基因在 ASD 患者中的表达出现异常
• 表观因素包括可变剪切、lncRNA、miRNA以及 DNA 甲基化和组蛋白修饰也与 ASD 有关

然而目前却还没有人研究 circRNA 在 ASD 发生发展中所扮演的角色。

3 月 3 日，台湾中央研究院基因组学研究中心的庄树谆团队在冷泉港期刊 Genome Research 上发表了一篇关于 circRNA 与 ASD 的文章：

从文章题目上看，我们就能大致知道这篇文章所做的工作：

• 从全基因组角度分析 ASD 中表达失调的 circRNA 分子
• ASD 中的 ceRNA 调控

文章结果似乎不是那么显眼：

• 通过尸检病人全基因组的表达分析，发现了 60 个 circRNA 与 3 个共调控模块在 ASD 中发生了异常
• 通过整合分析 circRNA, miRNA 以及 mRNA 数据，构建了 ceRNA 网络，并发现 mRNA 富集到了 ASD 风险基因以及抑制突触相关的基因
• 实验验证了 circARID1A 作为海绵吸附 hsa-miR-204-3p 从而调控一些 ASD 风险基因

亮点似乎也不多：

• 第一篇从系统角度研究 ASD 中 circRNA 调控网络的文章
• 提供了一个与 ASD 相关的 circRNA 候选分子集合以及对应的 circRNA-miRNA-mRNA 资源

而文章的研究思路也就是套路：

• 差异表达分析
• WGCNA
• ceRNA
• 数据库注释
• 实验验证

更重要的是，他的测序数据并不是自己的！

那么为什么文章能够发表到冷泉港实验室的期刊呢？

冷泉港实验室被誉为世界生命科学圣地、“分子生物学摇篮”，名列世界影响最大的十大研究学院榜首。^[2]

“事出反常必有妖”。实际上，读过全文之后，我认为这是一篇教科书式研究 ceRNA 的文章，虽然整体研究思路就是所谓的套路，但生物信息学工作与生物学实验都非常扎实。下面就让我们来剖析一下作者到底做了哪些努力：

名词解释

• ASD, Autism Spectrum Disorder，自闭症谱系障碍
• FC, frontal cortex，额皮质
• TC, temporal cortex，颞叶皮质
• CV, cerebellar vermis，小脑蚓部
• 混淆因子包括：性别、年龄、脑分区（FC 或 TC）、RNA 质量（RIN 值）、宿主基因的表达等等
• 重抽样：为了消除小样品带来的偏差，作者对样品进行了重抽样 70% 的样品 100 次进行差异表达分析
• DE-module：通过评估 module 特征基因与疾病状态的相关性得到的 module

这篇文章作为 ceRNA 研究入门是非常合适的，更多精彩的内容还请大家阅读原文一探究竟。

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延伸内容：中国孤独症现状摘录^[3]

• 世界自闭症关注日：每年的 4 月 2 日
• 发病率逐年增加
• 美国疾控中心统计 2016 年为 1.47%，而 2018 年为 1.69 %；韩国 2019 年发布的一个数据显示为 2.6%；2015年据我国发布的【中国自闭症教育康复行业发展状况报告I】中显示为 1%。按当时的 13 亿人口计算，至少有 1000万 的自闭症人群，其中儿童超过 200 万，而 2019 年【中国自闭症教育康复行业发展状况报告III】发布时可能已经超过了 300万。
• 致病原因：不明
• 是否可以治愈：目前无法治愈
• 目前治疗手段：通过教育康复减轻并融入社会，缺乏早期筛查与诊断，容易错过早期教育康复的黄金时期
• 患者生存状况：社会支持“悬崖式”的断层，尤其体现在对大龄一些人群的支持方面

1. 有时候，孤独是一种“病” https://songshuhui.net/archives/54131 ↑
2. CSHL冷泉港生物实验室期刊库及实验室指南 https://lib.cpu.edu.cn/ac/31/c1172a109617/page.htm ↑
3. 孙梦麟：《中国自闭症教育康复行业发展状况报告Ⅲ》发布 http://www.china.org.cn/chinese/2019-04/12/content_74673984.htm?f=pad&a=true ↑

10月7日，华盛顿大学医学院Carlos Cruchaga教授在Nature Neuroscience发表了一项circRNA的重要研究论文，报道发现一些阿尔兹海默症（AD）相关的circRNA分子可能是比较有价值的疾病标志物[1]。本文分析的数据来源于两个独立的RNA测序数据库，两个数据库所收集的AD和对照的标本均经过临床神经病理学验证。通过数据挖掘再分析得出相关的结论。

本文分析的数据来源于两个独立的RNA测序数据库，两个数据库所收集的AD和对照的标本均经过临床神经病理学验证。一个数据库是Discovery (Knight ADRC) and ADAD (DIAN) datasets，包含了13例对照和83例AD患者捐献的大脑顶叶皮层。另一个数据库是西奈山脑库（Mount Sinai Brain Bank, MSBB），其中包含40例对照和89例AD患者，还包括了31例高危患者及35例疑似患者。基于circRNA分析流程，作者从Discovery数据库中找到了3547个circRNA，在MSBB数据库中发现了3924种circRNA分子。进一步根据临床Braak打分和CDR打分（两种评价AD患者临床病理和测量指标）的情况进行相关性分析。Discovery数据库中找到了37个circRNA与AD病患形状高度相关，MSBB数据库中则发现了164个。

表1 AD相关circRNA分子汇总 （[1]）

作者分析了基于circRNA的预测结果与常规AD预测技术的比较，发现即使没有APOE4基因的预测分析，也能通过circRNA的表达对AD进行预测，并且circRNA的变化能更好的反映AD疾病的状态，暗示了circRNA作为AD疾病标志物的重要价值。

图1 AD相关circRNA分子及其验证 （[1]）

另一篇文章是发表在Biological Psychiatry杂志的，通讯作者是澳大利亚新南威尔士大学的Irina Voineagu教授[2]。该研究的数据一方面来源于此前Daniel Geschwind教授曾经发表在Nature的一项自病症大脑非编码RNA和可变剪切的研究工作中所测的数据（[3]），另有一部分数据来源于大脑类器官测序的在线数据（GSE99951）。本文也是基于已有的数据和在线数据的再分析和挖掘，发现其中的circRNA表达特征的。

在该研究中，研究者主要针对近197例健康对照和自闭症病例的人脑组织样本测序数据进行在分析，找出其中的circRNA分子。发现这些circRNA不是随机表达，具有主要表达模式的亚型。CircRNA表达在个体间的变异性不如大脑皮层和小脑之间的变异性明显。最后，研究者鉴定了自闭症样本中上调的circRNA共表达模块，从而为观察到的自闭症大脑中转录组变化增加了另一层复杂性。该研究为circRNA在大脑中的研究提供了一个全面的数据目录，并提供了免费网页工具查询浏览这些circRNA表达数据，为circRNA在大脑中的进一步深入研究提供了重要参考资源（资源网址：http://www.voineagulab.unsw.edu.au/circ_rna）。

图2 大脑circRNA表达分析 （[2]）

两篇文章发表的杂志都是非常有影响力的重量级杂志，通讯作者均为欧美地区的研究者，并且也都是采用了已有数据或在线数据的再分析，专门分析了其中的circRNA表达情况。这说明国际同行正逐步认可circRNA并开始相关的研究工作。

参考文献

1. Umber Dube, J.L.D.-A., Zeran Li, John P Budde , Shan Jiang, Simon Hsu, Laura Ibanez, Maria Victoria Fernandez, Fabiana Farias, Joanne Norton, Jen Gentsch, Fengxian Wang, the Dominantly Inherited Alzheimer Network (DIAN), Stephen Salloway, Colin L Masters, Jae-Hong Lee, Neill R Graff-Radford, Jasmeer P Chhatwal, Randall J Bateman , John C Morris, Celeste M Karch, Oscar Harari, Carlos Cruchaga, An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nature Neuroscience, 2019.

2. Gokool, A., F. Anwar, and I. Voineagu, The Landscape of Circular RNA Expression in the Human Brain. Biol Psychiatry, 2019.

3. Parikshak, N.N., et al., Genome-wide changes in lncRNA, splicing, and regional gene expression patterns in autism. Nature, 2016. 540(7633): p. 423-427.

最近发表在JOURNAL OF NEUROSCIENCE期刊（IF=6.074）上的一篇circRNA与脑缺血后再灌注损伤有关的研究论文，报道了circTLK1表达在小鼠脑局部缺血和再灌注后明显上调，其通过海绵miR-335-3p并抑制miR-335-3p活性，继而上调TIPARP基因表达，增加梗死面积，加重神经元损伤和神经功能缺陷的症状。通讯作者是来自东南大学医学院药理学系的姚红红教授。姚红红教授是今年第五届circRNA研究论坛的特邀嘉宾，一直关注和从事circRNA与神经炎性相关神经系统疾病的关系研究，欢迎大家踊跃参加。

敲低circTLK1表达减少缺血后脑梗死面积

作者通过在建立短暂的大脑中动脉闭塞小鼠模型tMCAO后，对比假手术组和缺血梗死组的组织中circRNA表达谱差异，筛选出缺血梗死组组织中表达上调水平较高的circTLK1。RT-qPCR验证发现circTLK1在小鼠众多器官中表达，尤其在脑、脾和肺的表达水平较高。同时在小鼠血浆和梗死同侧皮质中发现表达上调的circTLK1，而TLK1 mRNA和蛋白水平却出现下降。为了研究circTLK1在缺血性中风疾病过程起什么作用，作者构建circTLK1 shRNA慢病毒载体注射到小鼠侧脑室，IF验证病毒转染神经元成功，RT-qPCR验证体内敲低效果明显，3周后在小鼠身上建立tMCAO缺血再灌注模型，结果显示敲低circTLK1表达虽然不影响到脑血流量和缺血面积，但是会明显减轻神经功能缺陷症状（表现为神经系统缺陷评分降低），减少缺血再灌注后脑梗死体积。

敲低circTLK1表达减轻缺血后神经功能缺陷的症状

为了详细评估circTLK1对于小鼠中风后神经功能缺陷的影响，作者采用三个实验（神经系统缺陷评分、粘合剂去除试验和圆筒试验）进行评估tMCAO后第0, 3天和7天小鼠的早期症状。体内敲低circTLK1表达可明显减轻tMCAO后神经功能缺陷的症状（神经系统缺陷评分降低）和改善躯体感觉功能（粘合剂去除试验和圆筒试验）。而且敲低circTLK1表达可以明显减轻由tMCAO导致凋亡相关蛋白Bax/Bcl-xl和caspase-3/pro caspase-3比例上调的情况。

接着在评估tMCAO后第0, 14, 21和28天小鼠的晚期症状，发现敲低circTLK1表达依然可以改善tMCAO后神经功能缺陷的症状和改善躯体感觉功能，同时还可以减轻第28天脑萎缩的情况，增加梗死周边皮质的树突复杂性和树突棘的数目，rescue原本由tMCAO导致突触蛋白synapsin-1和PSD95蛋白水平下调的情况。

敲低circTLK1表达减轻脑中风导致的神经元损伤

在脑部众多细胞中，原代皮质神经元细胞中circTLK1的表达水平较高。神经元细胞经缺氧无糖后再灌注（OGD/R）处理模拟体内缺血再灌注后，circTLK1的表达水平明显上调，而TLK1 mRNA表达水平则下调。体外转染circTLK1 shRNA慢病毒可明显并特异地敲低circTLK1的表达，但不影响TLK1 mRNA表达。OGD/R处理可促进神经元细胞死亡，而同时敲低circTLK1表达则促进其存活。WB实验也证明了敲低circTLK1表达可明显降低Bax/Bcl-xl和caspase-3/pro caspase-3比例。

为了评估敲低circTLK1表达对于突触蛋白synapsin-1和PSD95的影响，转染circTLK1 shRNA可以明显上调OGD/R处理后神经元细胞中synapsin-1和PSD95蛋白水平，维持神经元marker– MAP-2水平和神经元突起的长度，保持轴突的长度和树突棘的数目，这些提示敲低circTLK1的表达对于神经元功能的维持和保护有重要的意义。

在神经元中特异性敲低circTLK1可有效保护神经元

作者构建含circTLK1 shRNA序列的腺病毒，注射到小鼠侧脑室，特异性敲低神经元circTLK1的表达，用于动态观察circTLK1在脑中风发生过程中的作用。特异性敲低神经元circTLK1的表达，虽然不影响到脑血流量和缺血面积，但是会明显减轻tMCAO后第3, 7天的神经功能缺陷症状和改善躯体感觉功能。

通过观察tMCAO后第14, 21和28天小鼠晚期症状，发现敲低神经元circTLK1的表达可明显减轻脑萎缩的症状，还可以改善神经功能缺陷症状和躯体感觉功能，进一步提示敲低神经元circTLK1的表达对于中风早期和晚期的重要保护意义。

敲低circTLK1表达保护神经元的机制是什么？

通过对比tMCAO组和假手术组的小鼠脑组织mRNA表达谱，发现脑梗死区域和周边区域的TIPARP mRNA水平明显下调。已有研究报道过，TIPARP参与缺血性脑损伤的发生过程。下一步作者通过数据库寻求靶向TIPARP和circTLK1的miRNAs，只有miR-335-3p, miR-320-3p 和miR-129-5p这三个候选分子。而经tMCAO后6h后缺血皮质中miR-335-3p的表达水平是明显下调的。那miR-335-3p与circTLK1是否存在结合作用呢？RNA-pull down证明miR-335-3p可以富集并结合circTLK1；而反向亲和分离实验证明circTLK1也可捕获并富集miR-335-3p。FISH实验证明miR-335-3p与circTLK1共定位于原代皮质神经元的胞浆中。

另一方面，那miR-335-3p与TIPARP是否存在结合作用呢？经数据库预测TIPARP mRNA 3’-UTR区域包含miR-335-3p结合位点。同时luciferase报告基因实验证明miR-335-3p与TIPARP 3’-UTR存在相互结合作用。体内实验发现经tMCAO处理12h 至第7天，缺血组织中TIPARP水平明显上调。经OGD/R处理后 ，皮质原代神经元中TIPARP表达水平也明显上调。另外，无论是否给予OGD/R处理，同时过表达miR-335-3p时，神经元中TIPARP表达水平则明显下调；当抑制miR-335-3p表达时，则出现相反的结果。这些结果提示circTLK1/miR-335-3p/TIPARP调控轴的存在。

circTLK1/miR-335-3p/TIPARP轴对于神经元损伤的意义

OGD/R处理可以促进神经元的死亡，同时过表达miR-335-3p则会维持神经元的存活，这可能与上调突触相关蛋白synapsin-1 和PSD95表达有关 ;而同时抑制miR-335-3p表达则无法维持其存活，这可能与synapsin-1 和PSD95表达下调有关。敲低circTLK1表达可明显抑制由OGD/R处理引起上调的TIPARP蛋白水平。敲低circTLK1表达可下调TIPARP蛋白水平，维持神经元存活的效应，会被anti-miR-335-3p处理所逆转，进一步说明circTLK1通过miR-335-3p调控TIPARP的表达。另外，敲低TIPARP表达会明显维持经OGD/R处理的神经元存活。体内实验也证明，tMCAO小鼠在敲低circTLK1表达后，脑组织中的TIPARP的表达也出现明显下调。

敲低miR-335-3p表达下调PSD95蛋白水平和降低树突棘密度的效应，会被敲低circTLK1表达所逆转。另外敲低TIPARP表达可逆转OGD/R处理所诱导PSD95蛋白下调的效应。体外OGD/R模型的基础上利用rescue实验验证circTLK1/miR-335-3p/TIPARP轴的相互调控关系。

在神经元中特异性敲低TIPARP表达可有效改善神经系统缺陷

构建含TIPARP shRNA序列的腺病毒注射入小鼠侧脑室28天后，在神经元中TIPARP表达可被特异性敲低。接着诱导tMCAO后，发现脑血流量和缺血面积不受影响，但是脑梗死体积明显减少，神经系统缺陷评分和躯体感觉功能得到明显改善。

经过长期观察（tMCAO后第28天），TIPARP敲低组小鼠脑萎缩的情况得到明显的改善，神经系统评分和躯体感觉功能也得到明显改善。原本在tMCAO后突触相关蛋白synapsin-1 和PSD95表达下调的情况，在同时敲低TIPARP表达后，这两种蛋白出现明显上调。

CircTLK1的临床意义是什么？

相比于健康人群，患有急性缺血性中风AIS的病人血浆中circTLK1表达水平出现明显上调。AIS疾病分为大动脉粥样硬化LA, 小动脉阻塞SA, 和心源性栓塞CE三种亚型，而只有LA和SA亚型患者血浆中circTLK1表达水平出现明显上调。通过对比发生中风的不同部位，发现只有患有皮质和皮质下梗死的患者血浆中circTLK1表达水平出现明显上调。ROC曲线分析显示circTLK1可能作为临床诊断AIS和提示AIS严重程度的重要标志物，而且AIS患者发生梗死面积越大，其circTLK1表达水平越高。

总结：作者通过对比正常脑组织，从tMCAO小鼠脑组织circRNA表达谱中筛选到表达上调程度相对高的circTLK1，首先从宏观表型分析，敲低circTLK1减少脑梗死面积，改善神经系统功能缺陷和减轻神经元损伤；接着微观机制研究，从tMCAO小鼠脑组织中筛选到已有研究报道过的TIPARP基因，再经生信分析预测并验证TIPARP和circTLK1两者之间的介导者—miR-335-3p。然后通过体外OGD/R证实circTLK1/miR-335-3p/TIPARP轴的相互调控对于保护神经元、改善神经系统功能缺陷的重要意义。最后回归临床，数据统计分析circTLK1有可能作为提示AIS严重程度的重要指标。总的来说，靶向敲低circTLK1和TIPARP表达、过表达miR-335-3p有助于改善AIS引起的神经系统缺陷症状和保护神经元不受损伤。这是少有的circRNA在神经系统疾病方面的研究，如果课题研究有关神经系统疾病方面，可借鉴本文的研究方法。

参考文献

1. Wu F , Han B , Wu S, et al. Circular RNA TLK1 aggravates neuronal injury and neurological deficits after ischemic stroke via miR-335-3p/TIPARP. J Neurosci. 2019 Jul 16. pii: 0299-19. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0299-19.2019.（解读用图均来自此文献）

其实，最常见的AD形式是迟发性阿尔茨海默氏症（LOAD），通常出现在65岁及以上的人群中。由于这种类型AD的遗传原因尚不清楚，所以它通常被称为散发性AD（sAD）。

尽管fAD和sAD之间存在差异，但它们具有共同的症状，导致脑损伤逐渐增加。 fAD和sAD的病理学标志分别是由Aβ积聚和tau过度磷酸化引起的斑块和缠结。 LOAD发展和进展的确切机制还未明确，此外， LOAD中Aβ积累的机制也是不清楚的。

环状RNA（circRNA）是进化保守的转录物，其通过5’和3’末端反向剪接从前mRNA衍生而来。circRNA在神经元中表达丰富。有趣的是，脑circRNAs在多种生物的衰老过程中受到调节，这表明circRNAs在脑老化和与衰老相关的神经退行性疾病中发挥着潜在的作用。

来自德国马克斯普朗克衰老生物学研究所的研究者于biorxiv网站在线发表的题为“The role of Aβ circRNA in Alzheimer’s disease: alternative mechanism of Aβ biogenesis from Aβ circRNA translation”的研究，发现了在阿尔茨海默病发病过程中Aβ circRNA可以形成Aβ肽的新机制，同时也揭示了circRNA可以翻译蛋白，这一重要功能对于生理或者病理过程的重要作用。（PS：该研究是研究人员的新发现，暂时未发表于任何正式杂志，原文需到biorxiv网站下载）

作者对两种可能形成Aβ肽的机制进行总结：左边是已有大量研究对家族性AD中Aβ肽形成机制的描述；右边则是本文发现的Aβ circRNA-a形成Aβ肽的新机制具体描述。

1. 通过深度测序数据分析APP基因来源的circRNAs

通过已有研究中的深度测序数据进行分析，挖掘到了人淀粉样前体蛋白APP基因来源的几种circRNAs，其中一种是包含Aβ肽ORF的circRNA（hsa_circ_0007556）。利用反向引物RT-PCR人脑样本来源的总RNA，电泳结果发现扩增产物中存在多种不同长度的APP基因来源的几种circRNAs（A）。同时对PCR扩增产物再次进行深度测序分析，发现了16种Aβ肽circRNAs，hsa_circ_0007556（Aβ circRNA-a）也包括在其中；对RNase R处理后的人脑组织来源的总RNA也经过上述相同处理，也可以发现这16种Aβ肽circRNAs中有15种是一样的，另外也发现了一种新的Aβ肽circRNA（table 1）。

在这些Aβ肽circRNAs中，Aβ circRNA-a含量最丰富，因此被选为后续Aβ circRNA功能研究的主要靶点，其RT-PCR扩增产物被克隆进入pCMV-MIR载体进行体外过表达后的功能验证。

2. 体内证实Aβ circRNA-a的存在并构建过表达载体进行研究

利用特异性引物对人脑额叶和海马组织来源的总RNA进行RT-PCR检测，明确了Aβ circRNA-a存在于人脑组织中（A，C）；为进一步探索Aβ circRNA的功能，作者通过内含子介导增强circRNA体外表达策略（后续会分享这种方法），体外构建了pCircRNA-BE-Aβ-a 和 pCircRNA-DMo-Aβ-a过表达载体（B），转染至HEK293后，RT-PCR检测发现其表达量分别增加了2185和3268倍(D），剪切位点序列与野生型Aβ circRNA-a一致，电泳明确了Aβ circRNA-a载体的过表达情况(C)，Sanger测序证明体外这种过表达的Aβ circRNA-a与天然产物的序列一致，Northern印迹实验也证明了Aβ circRNA-a体外过表达成功，RNase R处理证明其对该酶的耐受性，最重要的是，这两种过表达载体只会产生Aβ circRNA-a，而不会产生成熟线性RNA，造成产物污染，以保证后续功能验证的有效性；另外Aβ circRNA-a体外过表达并不会影响HEK293细胞内源性APP mRNA的表达。

3. 体外过表达的Aβ circRNA-a具有蛋白翻译功能

由于之前有研究报道某些circRNAs能被翻译成蛋白，而Aβ circRNA-a中包含基因ORF序列，所以作者通过构建载体于体外过表达Aβ circRNA-a后，WB检测到细胞中Aβ肽的表达条带约为15-20kDa，产物被称为Aβ circRNA-a-DP，其中在HEK293细胞可检测到Aβ circRNA-a的本底表达，而pCircRNA-DMo-Aβ-a载体过表达效率最高。有趣的是，作者发现Aβ circRNA-a的表达差异大，而其对应的Aβ circRNA-a-DP蛋白翻译水平差异不一定打， 说明存在未知的调控机制在调控circRNA的蛋白翻译。

4. Aβ circRNA-a可以形成Aβ circRNA-a-DP，最后形成Aβ肽？

Aβ circRNA-a可以被翻译成Aβ circRNA-a-DP蛋白，其序列中含有β和 γ-分泌酶剪切位点，提示Aβ circRNA-a-DP很有可能经过β和 γ-分泌酶蛋白水解过程形成Aβ肽。通过IP-WB实验检测到Aβ circRNA-a过表达的HEK293细胞上清中存在Aβ肽，其Aβ肽表达差异水平与Aβ circRNA-a-DP蛋白水平差异趋势几乎一致，说明表达上调的Aβ肽很有可能来自Aβ circRNA-a-DP。

5. Aβ circRNA-a形成Aβ肽，那么Aβ肽最终会形成Aβ斑块？

Aβ肽形成Aβ斑块是AD疾病的标志，既然Aβ circRNA-a可以形成Aβ肽，那么这Aβ肽是否可以形成Aβ斑块。作者通过体外电转染pCircDNA-DMo-Aβ-a质粒到小鼠胚胎神经元培养10天后，IF检测到相比于对照质粒组，pCircDNA-DMo-Aβ-a转染组的神经元出现Aβ斑块信号（红色荧光），绿色荧光为神经元，这提示在原代神经元中过表达Aβ circRNA-a后可以形成Aβ斑块。

6. Aβ circRNA-a过表达后形成的Aβ肽，对下游信号通路的影响？

在HEK293细胞中转染两种载体后过表达Aβ circRNA-a，WB检测发现其都能明显增强GSK3β蛋白、Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的表达水平，其中pCircRNA-DMo-Aβ circRNA-a质粒过表达后促进相关蛋白表达效率相比高点，提示过表达Aβ circRNA-a可以明显上调GSK3β蛋白表达和增强tau蛋白磷酸化。

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原文链接：https://www.biorxiv.org/content/early/2018/09/05/260968

德国神经退行性疾病中心的Günter U. Höglinger教授最近在Cell Death& Disease杂志发表题为“Exosomal secretion of α-Synuclein as protective mechanism after upstream blockage of macroautophagy”的研究，病理性α-突触核蛋白聚合物的累积在帕金森疾病中发挥重要的作用。巨自噬是包裹蛋白聚合物进入自噬体后，再融合到溶酶体降解它们的过程。由于作者之前的研究已经发现，药物活化巨自噬保护人神经元细胞免受α-突触核蛋白诱导的细胞毒性，所以猜想抑制巨自噬可能会加重α-突触核蛋白诱导的细胞死亡。但是通过沉默ATG5基因后抑制自噬体的形成，神经元细胞不会遭受α-突触核蛋白诱导的细胞毒性，这可能是在巨自噬被抑制后，存在一种胞内降解或者分泌病理性α-突触核蛋白的补偿途径。沉默ATG5基因并不会影响到泛素蛋白酶系统、分子伴侣系统、分子伴侣街道的自噬和未折叠蛋白反应，却影响到了外泌体分泌α-突触核蛋白的过程。而且阻断了外泌体的分泌会加重α-突触核蛋白诱导的细胞毒性。总之，该研究揭示了在巨自噬被抑制后，神经元细胞会分泌外泌体α-突触核蛋白来减轻胞内的蛋白降解负担，减少了细胞毒性的补偿性保护机制。

帕金森病（PD）是一种以黑质致密部多巴胺能神经元丧失和α-突触核蛋白（α-Syn）在路易小体和Lewy神经突的易受损神经元中积累为特征导致运动障碍的神经退行性疾病。

α-Syn是一种由三个域组成的小突触前蛋白。它的生理功能还没有被研究清楚。编码

α-Syn的基因SNCA发生点突变（如A30P，G51D，A53E，A53T，E46K）会导致常染色体显性的PD。另外，野生型SNCA的二倍体和三倍体也会导致常染色体显性PD。但是，单基因形式的PD是罕见的，而且大多数病例是散发性的。尽管如此，全基因组关联分析一致发现，SNCA的单核苷酸多态性为散发性的PD的主要危险因素。 α-Syn可以由细胞内不同的蛋白质降解机制降解，包括泛素 – 蛋白酶体系统（UPS），伴侣介导的自噬（CMA）或巨自噬（macroautophagy）。

巨自噬，在这里被称为自噬，是一个高度复杂的过程，它始于一个吞噬泡的形成。随后，吞噬泡形成双膜层结构，又称自噬体，是一种在自噬过程中负责吞噬不需要的蛋白质或细胞器的结构。接下来，自噬体融合溶酶体一起形成自噬溶酶体，开始对吞噬的东西进行真正的降解。自噬被认为是一种相当有选择性的过程，具有不同的自噬靶向细胞器（如线粒体自噬）或其他细胞内结构（如脂质吞噬体，聚合物吞噬体）的亚型。之前作者已经证明了药理性刺激自噬可以保护永生化人类多巴胺能神经元前体细胞(LUHMES)免受α-Syn诱导的毒性。于是作者探讨自噬抑制对于α-Syn诱导的细胞死亡的影响。

1. 首先发现了沉默ATG5可以保护LUHMES神经元细胞免受α-Syn诱导的细胞死亡

相比于（α-Syn过表达组，GAPDH siRNA组，GFP过表达组），（α-Syn过表达+ ATG5 siRNA）组的ATG5的mRNA表达和蛋白水平明显下调（a-c）；LC3B-I经磷脂酰乙醇胺连接后变成LC3B-II，作为自噬体的marker，可用于动态观察胞内的自噬流。细胞经氯喹（chloroquine）处理抑制自噬体融合溶酶体后，LC3B-II的蛋白水平明显上调，说明胞内存在正常的自噬流。而ATG5 siRNA+氯喹可以降低LC3B-II的蛋白水平，说明ATG5 siRNA可以抑制自噬体的形成（d-e）。通过定量细胞上清中的LDH释放水平检测ATG5 siRNA对于细胞活性的影响，相比于（α-Syn过表达组，α-Syn过表达+GAPDH siRNA组），α-Syn过表达+ATG5 siRNA组的LDH水平明显降低，代表其细胞毒性明显减小（f）。

1. 作者猜想沉默ATG5基因后，会活化胞内其它的α-Syn处理系统（如UPS、分子伴侣、CMA、UPR和释放α-Syn到细胞上清中）来补偿缺乏自噬降解的机制。

1. ATG5基因沉默不会活化泛素蛋白酶体降解UPS途径

给予10 μM MG132处理细胞4h，可抑制UPS，导致泛素蛋白的水平增加。假如α-Syn过表达+ATG5 siRNA组的细胞毒性减小是因为活化了UPS的话，无论给不给予MG132处理，ATG5 siRNA处理都会导致ubiquitin蛋白的水平增加。但是作者发现α-Syn过表达+ATG5 siRNA组的ubiquitin蛋白的水平并没有明显低增加，说明ATG5 siRNA处理并没有活化UPS途径（a-b）。

1. ATG5基因沉默不会增加补偿性分子伴侣的蛋白水平

分子伴侣靶向不可恢复地错误折叠的蛋白，以通过UPS和自噬途径降解。α-Syn过表达会增加胞内的HSP27蛋白水平，而α-Syn过表达+ATG5 siRNA组的HSP27蛋白水平没有明显的上调（a-b）。相比于其它组别，α-Syn过表达+ATG5 siRNA组的HSP70和HSP90蛋白水平也没有得到明显的上调（c-f）。

1. ATG5基因沉默不会增加补偿性CMA相关蛋白水平

含有KFERQ-基序的蛋白质底物可以被细胞溶质伴侣，大小约为70 kDa的热休克同源蛋白HSC70所识别，然后与分子伴侣一起锚定在溶酶体相关膜蛋白质类型2A（LAMP-2A），被内化到溶酶体降解。α-Syn过表达可以增加LAMP-2A 的蛋白水平，而ATG5 siRNA处理并没有在此基础上增加LAMP-2A 的蛋白水平（a-b）。而且各组间的HSC70蛋白水平也没有明显的差异（c-d），进一步说明了α-Syn过表达+ATG5 siRNA组不会活化补偿性CMA相关蛋白。

1. ATG5基因沉默不会活化补偿性的UPR相关蛋白水平

未折叠蛋白反应UPR是一种弃掉错误折叠蛋白的系统，可以被累积在内质网内的错误折叠蛋白所活化，可通过三种应激感应器感应（真核翻译起始因子2 alpha激酶3（EIF2AK3），肌醇必需酶1α（IRE1α）和激活转录因子6（ATF6）。α-Syn过表达可以增加EIF2AK3、pEIF2A 、总IRE1α、pIRE1α的蛋白水平，而ATG5 siRNA处理在此基础上并没有增加EIF2AK3 、pEIF2A、总IRE1α、pIRE1α的蛋白水平（a-h）。α-Syn过表达或者ATG5 siRNA处理都不会影响到XBP1和ATF6蛋白水平（i-l）。这提示α-Syn过表达+ATG5 siRNA处理不会激活补偿性的UPR。

1. ATG5 基因沉默会增加外泌体中α-Syn的分泌

α-Syn过表达四天后可在细胞上清中检测到α-Syn蛋白的分泌，再给予ATG5 siRNA处理后，α-Syn过表达细胞会增加分泌α-Syn蛋白到细胞上清中（a, b）；α-Syn过表达会明显增加胞内α-Syn蛋白的表达，但是给予ATG5 siRNA沉默ATG5或者GW4869抑制外泌体分泌后，胞内α-Syn蛋白并没有累积的更多（c, d）; α-Syn过表达会明显增加从上清中分离的胞外囊泡部分中的CD81和α-Syn蛋白水平，再给予ATG5 siRNA处理后CD81和α-Syn蛋白水平进一步增加了，提示经过沉默ATG5处理后外泌体的分泌和其中的α-Syn蛋白分泌都增加了，而再同时给予GW4869刺激，这种蛋白进一步增加的现象就消失了（e-h）；同时作者也对上清分离的非囊泡部分进行了WB检测，发现无CD81蛋白的存在，说明这部分确实是非囊泡蛋白，而且无论α-Syn过表达处理还是ATG5干扰，都无法增加上清非囊泡部分的α-Syn蛋白分泌，而给予GW4869刺激后α-Syn蛋白分泌增加（i-k），提示抑制自噬后，细胞通过外泌体分泌α-Syn蛋白增加，但当自噬和外泌体分泌都被抑制后，细胞直接释放α-Syn蛋白到上清中。原本沉默ATG5可以减轻α-Syn过表达造成的细胞毒性，但是同时给予GW4869抑制外泌体分泌后，无法减轻α-Syn过表达造成的细胞毒性（l），提示外泌体分泌α-Syn蛋白，对于减轻α-Syn累积造成的细胞毒性是非常的重要。

参考文献

1. Fussi N, Höllerhage M, Chakroun T. et al..Exosomal secretion of α-synuclein as protective mechanism after upstream blockage of macroautophagy. Cell Death Dis. 2018 Jul 9;9(7):757. doi: 10.1038/s41419-018-0816-2.