circRNA与mRNA互作

韩国科学技术院Yoon Ki Kim研究团队揭示了circRNA可通过与mRNA的3′ UTR相互作用，将其携带的外显子连接复合体（EJC）定位在mRNA的3′ UTR附近，从而靶向调控无义介导的mRNA降解(NMD)机制。人工设计的circRNA，可靶向下调mRNA水平，为circRNA在基因沉默和疾病治疗中的潜在应用开辟了广阔前景。^[11]
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肿瘤疫苗类型包括肽/蛋白、树突状细胞(DC)和核酸(包括DNA和RNA疫苗)。其中RNA疫苗可在细胞质内快速表达抗原，从而导致强大的免疫激活，还可避免基因组整合和T细胞耐受性相关风险。加之circRNA的独特优势，可成为极具前景的肿瘤疫苗载体。

斯坦福大学的张元豪和Wender研究团队利用circRNA编码卵清蛋白 (OVA)^[27]，多伦多大学李博文团队利用circRNA编码IL-12^[28]、福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙/赵必星团队利用circRNA编码新抗原PTPN2多肽片段^[29]，结果发现这些circRNA肿瘤疫苗均可在模型体内诱导强烈的抗肿瘤免疫反应，且能强效、安全、稳定抑制肿瘤生长，甚至清除肿瘤，效果显著优于线性mRNA，且无明显副作用。

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中山大学附属第一医院张弩团队联合吉赛生物团队开发表达lncRNA编码肽肿瘤抗原的疫苗circH19-vac，可触发针对胶质母细胞瘤的强效细胞毒性T细胞反应并抑制肿瘤生长。^[30]

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circRNA还有望成为优越的肿瘤抗原载体，开发有效的DC疫苗。吉林大学张海红团队开发编码肿瘤抗原FAPα和survivin的circRNA DC疫苗，可显著抑制肿瘤生长，与吉西他滨药物进行联合治疗，显著延长了胰腺癌小鼠的存活率。^[31]

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图4 circRNA疫苗激活免疫反应。^[32]

CAR-T疗法

肥胖在世界范围内构成日益严重的健康负担。了解肥胖组织发育、能量存储和营养稳态的潜在机制对于研发肥胖及其合并症的新疗法是十分重要的。非编码RNA正在成为脂肪细胞分化和功能的新型调控分子，circRNA作为一类新的单链闭合环状非编码RNA，它在脂肪生物学中的功能尚未被挖掘。本篇文章中，作者首先分析了深度RNA测序（RNA-seq）数据集，并鉴定了数千种脂肪表达的circRNA。随后，选择一组高度丰富、保守和脂肪富集的候选circRNA，来检测它们在脂肪形成和肥胖过程中的动态表达模式。结果表明，circArhgap5-2是体内和体外成脂基因程序必不可少的驱动分子。

1、脂肪circRNA的整体表达分析

作者对人内脏（网膜）和皮下脂肪组织以及小鼠附睾和腹股沟脂肪中提取的去除核糖体RNA的总RNA进行了深度RNA测序。4个RNA-seq文库中的每一个测序均实现了127±10 million配对末端读取。使用Tophat2将它们与参考基因组（人类的hg19，小鼠的mm9）进行比对，具有≥80％的高映射效率。使用Cufflinks2（v.2.2.1）对基因表达进行量化，并以FPKM为单位进行报告。每个文库均显示一系列高水平的表达基因（FPKM>1），在所有人类和小鼠样本中分别检测到超过16,000个基因和14,000个基因。

作者选取一种高效且无偏差的算法-CIRI2，用于circRNA鉴定。CIRI2根据严格筛查标准鉴定出以头尾反向剪接区域（BSJ）为特征的circRNA。在GENCODE v.19标注人类circRNA后，作者发现大多数circRNA（5,651 / 6,925，81.6％）均来自编码外显子，其余来自内含子（376 / 6,925，5.4％）、外显子-内含子边界（190 /6,925，2.7%）和其他位点（708 / 6,925，10.2％）。在小鼠中也观察到了类似的分布。将得到的脂肪circRNA列表与公开可用的circBase数据库进行比对，结果显示RNA seq发现了952种新的circRNA亚型。

作者标注了脂肪文库中表达最高的100个circRNA。其中，丰度最高的人类circRNA circHIPK3-1，其亲本基因产生的另一种环状异构体，可充当miRNA海绵。circZNF609-1是人类第四高表达的候选circRNA，据报道它可以被主动翻译成截短肽。排名前10位的其他高丰度的circRNA是从RHOBTB3、COL3A1、SMARCA5、ESYT2、ASPH、LPAR1和CORO1C基因转录而来的，这些基因的线性mRNA可编码结构或酶调节蛋白。在产生最多的circRNA亚型的宿主基因中（例如AHNAK、ZNF124、NRIP1、ASPH和PDE3B），其也会通过广泛的可变剪接产生多个线性转录本。总体而言，每个人类外显子circRNA的外显子预测中位数为3，其中，10.6%的circRNA仅包含一个外显子，6.2%的circRNA超过10个外显子。有趣的是，关键的白色脂肪细胞调节因子，例如PPARγ、LEP、ADIPOQ、FABP4和INSR，均能在人类脂肪中产生可检测的外显子环状RNA。

当比较人类和小鼠皮下脂肪和内脏脂肪之间circRNA的归一化丰度时，作者观察到两个脂肪库中的表达模式之间有很好的相关性。尽管如此，少数circRNA也显示出库特有的分布，包括仅在内脏中检测到的circRNA (例如，circEPB41L2-2、circNCL-2、circHNRNPA2B1-1、circEFEMP1-1、circCOL1A1-1和circMETRNL-1)，或者仅在皮下脂肪中检测到的circRNA(例如，circVIM-1、circFBLN2-1、circCOL1A2-1、circ-COL4A2-1和circFBN1-4)。此外，在两种类型的白色脂肪组织（WAT）中，反向剪接与线性剪接比率（BSR）的分布是一致的，这表明相对于宿主基因中的线性转录，两种组织中的circRNA生成受到类似的调控。从总体来看，内脏和皮下脂肪中环状转录本的丰度大大超过其同源线性转录本，但是一小部分circRNA丰度与线性转录本相似，或者更高。高表达线性转录本的宿主基因倾向于产生更多circRNA亚型，但是这种比例关系不是完全线性的，这表明circRNA的生物发生受到基因座基础转录以外的其他调控层的调控。

接下来，为了鉴定脂肪中富集的circRNA，作者对ENCODE Project Consortium下载的人类组织RNA测序数据集应用相同的算法，并将这些文库中的circRNA表达谱与作者得到的脂肪circRNA列表进行比对。结果显示，在circRNA列表中，有1,810种circRNA（占26.1％）仅在人类脂肪数据集中检测到，表明这些circRNA具有高度组织特异性。

根据同源基因的人和小鼠BSJ序列之间≥70%的序列同源性标准，作者额外鉴定了120种物种保守的circRNA。他们在人和小鼠脂肪样品之间显示出相似的相对表达。有趣的是，与非保守的circRNA相比，它们表现出更高的丰度，这表明这些保守的circRNA可能与脂肪功能相关。

图1 环状RNA的整体表达分析

2、脂肪circRNA的实验验证

接下来，作者选取circRNA在脂肪组织中进行进一步的验证和鉴定。在保守的circRNA子集中，作者根据BSJ读取计数选取了20种在人类或小鼠脂肪组织中表达最高的circRNA，以及脂肪最富集的15种circRNA。由于PCR的检测限制，使长度小于90bp的circRNA被排除在外，最终仅得到含41个候选circRNA的集合。随后，作者设计并合成可以特异性扩增circRNA的发散引物，进行逆转录PCR（RT-PCR），成功地在小鼠脂肪组织中检测到37个候选circRNA的反向剪接。对于每个候选基因，凝胶提取预期大小的条带，并通过Sanger测序确认其头尾剪接序列。

为了确认反向剪接序列是否确实反映环状结构或仅仅是由基因组串联重复或外显子重组衍生的线性连接体，作者对其中10个circRNA进行RNase R处理的RT-PCR分析，显示他们均存在RNase R抗性，这表明他们确实具有环状结构。因此，在分析中检测反向剪接序列是证实这些转录本环状结构的可靠指标。

接下来，作者将验证预测结果是否可以真正反映circRNA在体内的表达水平。作者使用BSJ特异性引物的实时定量-反转录PCR （RT-qPCR），来量化12个推定的脂肪富集的circRNA在不同小鼠器官和脂肪库中的相对丰度，包括circAbca1-2、circCrim1-2、circHspa4-3、circMap2k1-1、circMed13l-1、circPhkb-2、circSkap2-1、circTshz2-1、circAsph-9、circHipk3-1、circNfix-2和circOgdh-2。12个circRNA均优先在棕色脂肪组织(BAT)和/或WAT中表达。与circRNA相比，他们的线性同源物的分布在不同组织之间表现出更大的分散性，并在脂肪中特异性更低。这与先前的发现相符，即除其宿主基因的转录活性外，circRNA的组织特异性表达还受其他调控层的调控。作者还检测了预计不会在脂肪中富集的十种circRNA的相对丰度，不出所料，这些circRNA及其线性同源物均未显示出明确的脂肪特异性表达。

为了确定候选circRNA的亚细胞定位，作者分离了腹股沟脂肪的胞核和胞质部分，并通过RT-qPCR来定量其中circRNA的相对丰度。大多数候选circRNA主要在胞质中表达，这可能与他们的功能相关。此外，由于脂肪组织由多种细胞类型组成，因此作者探索这些circRNA在成熟脂肪细胞中的表达与基质血管部分（SVF）的关系，以确定他们的分布。结果表明，大多数circRNA在成熟的脂肪细胞中优先表达。

图2 脂肪circRNA的验证、组织特异性和细胞定位

3、circRNA在脂肪细胞分化过程中表达上调

为了检测作者之前验证的circRNA在脂肪形成过程中的转录变化，在不同的时间点收集了化学诱导分化的原代小鼠前脂肪细胞的总RNA，通过RT-qPCR来定量整个时间过程中circRNA及其同源线性转录物的表达水平。在脂肪形成过程中，大多数circRNA（31/37）显示出2倍以上的上调，这与线性mRNA水平的升高密切相关。

为了量化分化过程中环形和线性转录本的共表达，作者计算了整个时间过程中每个circRNA-信使RNA对的Pearson相关系数（PCC）。所有circRNA的表达均与其同源线性转录物呈正相关，37个circRNA中的32个（86.5％）显示r> 0.6，37个circRNA中的18个（48.6％）显示r> 0.9的强相关阈值。因此，结果表明，成脂过程中circRNA的动态表达变化很大程度上取决于其宿主基因的转录调控。有趣的是，有六种circRNA–mRNA对在环状和线性转录本之间表现出截然不同的表达模式（circAbca1-2、circArih1-1、circArhgap5-2、circNfib-2、circPhkb2-1和circTshz2-1）。与相对静止的同源mRNA相比，这些circRNA的积累速度要快得多。因此，除了circRNA的低衰减率之外，调节pre-mRNA反向剪接的阶段特异性因子可能会驱动独立于线性mRNA的环状异构体的产生。

4、circRNA在饮食诱导的肥胖中表达下调

接下来，作者通过比较高脂饮食（HFD）和正常饮食C57BL/6小鼠脂肪组织中circRNA的表达差异，来评估肥胖对体内circRNA表达的影响，以经典肥胖模型中分别上调和下调的脂肪因子瘦素和脂联素的表达作为对照。值得注意的是，在HFD条件下，观察到37个circRNA中有33个在附睾WAT中显著下调，其中19个具有统计学意义。在HFD小鼠的腹股沟皮下脂肪组织中circRNA也有类似的下降趋势。对于内脏脂肪，线性mRNA通常随着circRNA丰度的降低而下调。有趣的是，在腹股沟脂肪中，这些mRNA中的大多数以相反的方式上调，与下调的circRNA相反。因此，HFD对皮下脂肪circRNA的调控不能完全归因于宿主基因转录活性降低，应在转录后水平存在额外的调控机制。

考虑到circRNA在肥胖中的普遍下调，作者随后将研究的重点放在调控circRNA的机制中。过度肥胖通常会导致单核细胞和其他免疫细胞募集到脂肪库中，从而释放细胞因子来激活慢性炎症。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种重要的促炎细胞因子，肥胖时其水平明显升高。因此，作者测试了肥胖中TNF-α诱导的脂肪细胞炎症是否参与调控circRNA的异常表达。在可溶性TNF-α（sTNF-α）处理分化的原代小鼠皮下脂肪细胞24小时后，发现37种circRNA中有31种circRNA表达降低，其中19种显示出明显降低。有趣的是，circRNA的倍数变化与其线性同源转录物的相关性很差（R²=0.034），只有少数mRNA在sTNF-α处理后显著下调。因此，成熟脂肪细胞中炎症通路的激活有助于肥胖对circRNA表达的抑制作用，提示炎症可能对circRNA的生成具有转录后影响。

图3 circRNA在脂肪形成和肥胖过程中的表达

5、circTshz2-1和circArhgap5-2对于脂肪形成必不可少

为了探索circRNA在脂肪形成过程中的功能，作者使用RNAi技术来敲低circTshz2-1和circArhgap5-2，这两个候选circRNA在分化过程中相对于其线性同源转录本高度上调，线性mRNA在分化过程中没有明显变化。在小鼠和人类的保守的circRNA子集中，circTshz2-1和circArhgap5-2分别在脂肪中高度富集。

circTshz2-1是一种有方向感的环状转录本，起源于teashirt锌指同源盒2（Tshz2）基因座 ，该基因是来自参与癌症进展和胚胎发育的转录因子蛋白家族的保守基因。circTshz2-1包含其线性同源转录物外显子2的第一个2,934 bp，BSJ临近于外显子2的5’端和下一个传统外显子-内含子边界上游的3’内部剪接位点。原代白色脂肪细胞分化的第6天（D6），circTshz2-1丰度增加了四倍，而Tshz2 mRNA的水平保持相对不变。

作者设计并合成了三个靶向不同转录本的Dicer底物小干扰RNA（DsiRNA）：si-circ仅与环状转录本的BSJ结合，si-lin与未纳入circRNA的3’UTR序列互补，仅靶向circRNA的线性同源转录本，si-circlin与环状和线状转录本共有的外显子区域相结合，从而敲低这两种转录本。将DsiRNA转染原代小鼠白色前体脂肪细胞中，RT–qPCR验证了分化前后circTshz2-1和Tshz2 mRNA的敲低效率。

为了评估circRNA缺失对脂肪形成的影响，作者通过亲脂荧光团BODIPY 493/503和油红O（ORO）染色成像来观察脂滴（成熟脂肪细胞的标志）的积累。si-circ和si-circlin会抑制脂滴的累积，而单独敲低Tshz2 mRNA则没有这种抑制效应。此外，RT-qPCR分析显示，si-circ和si-circlin而非si-lin抑制了成脂标记物Pparγ、AdipoQ、C /ebpα和Fabp4的表达。值得注意的是，低丰度环状异构体circTshz2-2源自Tshz2的全长外显子2，但他的表达不受circTshz2-1基因敲低的影响。因此，抗分化表型是circTshz2-1沉默所特有的。

作者同样应用RNAi技术，来探索另一个候选基因circArhgap5-2对脂肪细胞分化的影响。circArhgap5-2是由其线性转录本的整个外显子1和2的反向剪接生成，Arhgap5 mRNA可以编码调节性Rho GTPase激活蛋白5（Arhgap5）。理论上，circRNA可以包含或排除插入的内含子序列。为了推测其结构，作者设计了两组引物来特异性地扩增仅含外显子和保留内含子的circArhgap5-2亚型。为了检测仅含外显子的结构，作者使用与上游外显子的5’（反向引物R）和3’（正向引物F1，F2，F3）远端相对应的不同发散引物进行RT–PCR，来扩增仅含外显子的circArhgap5-2。同样，为了检测保留内含子的circRNA亚型，作者将反向引物R与另一组与内含子序列互补的正向引物（F4，F5，F6）相配对。结果显示，仅外显子引物扩增了预期大小的PCR产物，内含子引物并没有扩增出可检测的条带，从而证实了circArhgap5-2是一个仅含外显子的4,037-bp大小的环状结构。

原代白色脂肪细胞分化的第6天（D6），circArhgap5-2 水平增加了33倍，其同源线性转录物水平仍然保持稳定。与circTshz2-1相似，作者利用DsiRNA特异性地敲低原代脂肪细胞分化前后的circArhgap5-2及其同源线性转录物，敲低效率使用RT-qPCR证实。si-circ和si-circlin敲低sircArhgap5-2会导致脂滴积聚明显受到抑制，并显著下调成脂标志物的表达，而si-lin单独敲低线性转录本并不能抑制脂肪细胞分化。综上所述，作者的体外研究结果证明了circRNA候选物在脂肪形成调控中的功能作用。

在circArhgap5-2的RT-PCR分析中，作者观察到了circRNA的一个较短异构体circArhgap5-1，它是由Arhgap5外显子1的反向剪接形成。作者想知道circArhgap5-2的敲低是否会影响circArhgap5-1的表达。使用异构体特异性引物，证明了siRNA介导的circArhgap5-2敲低不会显着影响circArhgap5-1水平。此外，用异构体特异性DsiRNA沉默circArhgap5-1也不会影响circArhgap5-2的表达，只会导致成脂标志物的轻度抑制。因此，脂肪形成受阻主要是由于circArhgap5-2的缺失。

接下来，想知道哪个成脂阶段受circArhgap5-2和circTshz2-1敲低的影响，作者在前脂肪细胞转染了DsiRNA，然后在细胞分化过程中的不同时间点检测成脂标记物的水平。在前脂肪细胞阶段和成脂早期(直到D1)，基因敲低对成脂标志物没有影响。只有在D2时，细胞才开始表现出明显的成脂标志物表达缺陷。因此，这些环状RNA是在分化中期开始驱动脂肪生成。

图4 敲低circTshz2-1会抑制脂肪形成

图5 敲低circArhgap5-2会抑制脂肪形成

6、circArhgap5-2维持脂肪细胞的整体基因程序

现在，作者想要评估circArhgap5-2是否在维持成熟脂肪细胞的成脂基因程序中起着关键作用。作者使用靶向circArhgap5-2 BSJ的腺病毒shRNA（sh-circ）转染分化的脂肪细胞(D4)，与阴性对照（sh-NC）相比，转染后2d显示出>70%的基因敲低效率，且不影响Arhgap5 mRNA水平。然后，作者对脂肪细胞样本进行poly(A) RNA-seq，随后进行基因集富集分析(GSEA)。sh-circ和sh-NC之间差异表达基因的排序列表被用作查询MSigDB标志性基因集的预先排序的GSEA运行的输入。脂肪酸代谢和脂肪生成是下调最严重的功能途径，这表明成熟脂肪细胞中circArhgap5-2的缺失会导致脂肪细胞转录程序的整体抑制。与之一致的是，在circArhgap5-2敲低后，脂肪细胞的关键标志物（Pparγ、 AdipoQ、 C/ebpα、 Fabp4、Glut4和Lipe）在转录和蛋白水平上均相应降低，尽管没有检测到对脂质积累的明显影响。总之，circArhgap5-2对于成熟脂肪细胞在体外维持其基因表达程序是必不可少的。

接下来，作者将检测circArhgap5-2是否同样在体内维持脂肪细胞的基因程序。作者将腺病毒shRNA注射到8周大的C57BL/6 小鼠的腹股沟脂肪垫中，在转染后7d，观察到所有重复组中circArhgap5-2的敲低效率均大于70%。对三重对照和sh-circ组的脂肪组织样品进行mRNA-seq，随后再进行差异表达和DAVID通路分析。与体外结果一致，许多显著下调的基因与脂肪生成相关，下调最明显的基因与脂肪细胞的关键代谢和合成代谢功能相关。上调最显著的基因与炎症途径相关。RT-qPCR和western blotting证实敲低circArhgap5-2会导致脂肪细胞标志物 Fabp4和Pparγ的表达降低，并在转录水平上诱导炎性标志物F4/80、Itgam和Il6的表达。经sh-circ感染的脂肪组织染色显示，脂滴大小减小，反映脂质代谢紊乱。总之，作者的发现证实了circArhgap5-2是维持体内成熟脂肪细胞关键特征不可或缺的调节因子。

图6 circArhgap5-2维持整体成脂基因程序

图7 体内敲低circArhgap5-2可下调成脂基因表达

7、circArHGAP5-1的促成脂功能在小鼠和人脂肪细胞之间保守

circArHGAP5-1是circArhgap5-2的一个同源环状转录本，作者的数据显示，它为人类脂肪中第13高表达的保守异构体。circARHGAP5-1的BSJ来自经典pre-mRNA的外显子2和3的反向剪接，它们与小鼠同源物中环化的两个相同外显子具有93.5%的序列同源性。相应地，BSJ也高度保守（50bp范围内94%的同源性）。与小鼠中观察到的结果相反，在人类白色脂肪细胞分化过程中，circARHGAP5-1的表达没有明显变化。作者想要确定它在脂肪形成中的重要作用是否保守。作者使用靶向circARHGAP5-1 BSJ的慢病毒shRNA（hsa-sh-circ）来进行敲低，在永生的人白色脂肪祖细胞分化前后，观察到circARHGAP5-1的敲低效率均>70%。值得注意的是，作者发现敲低circARHGAP5-1会显著下调脂肪细胞标志物（PPARγ、 FABP4、 GLUT4和CIDEA）的表达，这表明敲低circARHGAP5-1可显着抑制脂肪生成和脂质堆积。总之，circARHGAP5-1的促成脂功能在小鼠和人脂肪细胞之间保守。

图8 circARHGAP5-1功能在人体脂肪细胞中保守

8、circArhgap5-2不能作为miRNA海绵分子

有研究表明，circRNA可以海绵吸附miRNA，从而阻止miRNA对靶标mRNA的沉默效应。circArhgap5-2序列包含多个miRNA结合位点，作者推测它可能通过海绵吸附抗成脂miRNA而发挥作用。

假如circRNA可以海绵吸附miRNA，它的缺失将导致游离miRNA的增加，促进其对下游靶基因的沉默，进而影响靶基因表达。如果，circArhgap5-2的缺失不能显著影响其预测结合的miRNA的靶基因表达，则不应认为它是miRNA海绵。利用TargetScanMouse数据库，作者鉴定出43种保守性不同的miRNA，对应于circArhgap5-2内的66个种子序列结合位点，并分别为这43种miRNA提供相应的靶标mRNA。使用脂肪组织circArhgap5-2敲低的mRNA-seq数据集，作者绘制了每个miRNA的所有靶mRNA的表达变化倍数的累积分布，并与所有其他转录本的参考分布进行比对。作为阳性对照，作者将之前的操作应用于已发表的转染miR-155的HeLa细胞数据集，并观察到其靶标mRNA累积分布曲线的预期左移，证实miR-155对这些mRNA的抑制作用。然而，circArhgap5-2缺失并没有影响43种miRNA的所有靶标mRNA分布。随后，作者对成熟脂肪细胞的体外基因敲除数据集进行了类似的分析，得到了同样的否定结果。

此外，证实circRNA作为miRNA海绵分子，需要证明circRNA与RISC的核心蛋白Argonaute-2（AGO2）之间的互作。作者使用AGO2抗体进行RNA免疫沉淀，然后用RT-qPCR检测AGO2是否可以下拉circArhgap5-2。在AGO2下拉的几个RNA中，并没有检测到circArhgap5-2，这表明两者之间没有相互作用。综上所述，circArhgap5-2不太可能通过海绵吸附miRNA来调控脂肪形成。

9、circArhgap5-2不能编码肽

在排除miRNA的海绵化机制后，作者探索circArhgap5-2是否像早期的circRNA研究所报道的那样编码新的功能肽。circArhgap5-2含有一个假定的开放阅读框，可能会编码肽。作者在原代培养的脂肪细胞中进行多核糖体图谱分析，以确定circArhgap5-2和circTshz2-1是否与核糖体相关联。虽然Srebp1仅存在于多核糖体组分中，但没有类似地检测到circArhgap5-2和circTshz2-1，表明circArhgap5-2和circTshz2-1并没有被翻译。

参考文献：

[1] Arcinas C, Tan W, Fang W, et al. Adipose circular RNAs exhibit dynamic regulation in obesity and functional role in adipogenesis. Nat Metab. 2019, 1(7):688-703. doi:10.1038/s42255-019-0078-z

环状RNA(circRNA)在哺乳动物大脑中含量丰富，有些circRNA显示出年龄依赖性的表达模式。本篇文章中，作者报道一种保守的circRNA—circGRIA1，它是兴奋性氨基酸受体-AMPA受体亚基Gria1基因衍生的circRNA亚型，circGRIA1主要位于细胞核，在猕猴前额叶皮层和海马中表现出与年龄相关的表达增加。circGRIA1与Gria1基因的启动子区域存在关联，并可以负向调节Gria1 表达。敲低circGRIA1可显著地改善老年雄性猕猴海马神经元的突触再生及GluR1依赖的突触可塑性。该发现强调了circRNA调控的重要性，并提供了对大脑衰老生物学的新见解。

1、猕猴大脑中circGRIA1显示出年龄和性别依赖性的表达模式

在此之前，作者使用深度RNA图谱，绘制过猕猴大脑衰老过程中circRNA表达变化的综合图谱。为了探讨circRNA及其亲本mRNA表达与年龄之间的变量关系，作者选出11种表达与衰老相关的circRNA作为候选分子。在本项研究中，作者选取了其中一种circRNA—circGRIA做进一步分析。作者发现总共有12种来自Gria1基因座的circRNA亚型，包括2个单外显子、9个多外显子和1个内含子circRNA。其中，circGRIA1是由Gria1基因外显子4、5、6形成的进化保守亚型，在20岁雄性猕猴样本中高表达。重要的是，circGRIA1与其亲本mRNA（Gria1）的表达呈负相关。

接下来，作者从冷冻的10岁和20岁雄性猕猴脑样本中提取RNA，进行qPCR来检测circGRIA1和Gria1 mRNA的表达水平，验证了circGRIA1与Gria1 mRNA表达的负相关，且发现比较于10岁雄性猕猴，circGRIA1在20岁雄性猕猴的前额叶皮层（PFC）、OC、海马CA1和齿状回（DG）中表达上调。随后，作者使用针对环化位点的探针（专门识别Gria1环状转录物）和来自外显子的探针（可识别Gria1线性和环状转录物）进行Northern blot，来进一步验证10岁和20岁雄性猕猴海马中circGRIA1的表达差异，结果与上述一致，circGRIA1表达在20岁雄性猕猴海马中显著上调。令人惊讶的是，circGRIA1表达在10岁和20岁雌性猕猴中并无差异，且表达较低。以上实验结果表明，在雄性猕猴大脑中circGRIA1显示出衰老相关的表达模式。将RT-PCR产物的Sanger测序结果与Gria1基因组进行比对，进一步证实circGRIA1来源于Gria1基因组。由于circGRIA1的亚细胞分布可以决定其功能。因此，作者通过RT-qPCR分析了20岁雄性猕猴海马组织中胞质和胞核内circGRIA1的表达水平。结果表明，circGRIA1主要定位于胞核。

图1  circGRIA1和Gria1 mRNA表达的特征

2、circGRIA1与Gria1 mRNA的表达呈负相关

接下来，作者决定探索circGRIA1表达是否与大脑衰老的生物学过程相关。首先，作者使用BASEscope原位杂交（ISH），来证实在雄性猕猴的PFC、CA1和DG中circGRIA1表达随年龄增长而上调，Gria1 mRNA表达则随着年龄增长而下调。有趣的是，在20岁雌性猕猴的PFC和海马中，没有检测到circGRIA1表达与年龄相关的增加，但是作者发现了Gria1 mRNA表达与年龄相关的减少。免疫组化（IHC）和western blot结果显示，在20岁雄性、雌性猕猴的PFC和海马中GluR1表达均减少。这表示，在雌性和雄性猕猴大脑内调控Gria1表达和功能的机制有所不同。

接下来，作者调查，在体外培养的胎儿猕猴海马神经元中，circGRIA1表达是否也显示年龄的依赖性。作者使用BASEscope ISH和RT-qPCR检测了体外培养14天（DIV14）和DIV28的雄性胎儿猕猴海马神经元中circGRIA1的表达水平，结果与体内实验相一致，DIV28神经元中circGRIA1表达水平高于DIV14，而Gria1则相反，它在DIV28神经元中表达下调。

图2  circGRIA1和Gria1 mRNA表达呈负相关

3、circGRIA1可以结合其亲本基因启动子

最近有研究表明，circRNA的基因调控功能是通过其与线性天然mRNA剪接所需因子的竞争性结合来实现。在这种情况下，它们是mRNA成熟的重要调节因子。为了探讨circGRIA1是否以顺式作用方式负向调节其亲本mRNA表达，作者采用染色质分离RNA纯化技术(ChIRP)，通过与circGRIA1环化位点互补的生物素标记寡核苷酸，来检测cicGRIA1共沉淀的基因组DNA。体内和体外实验均证实Gria1可以与cicGRIA1直接结合，因此，作者将分析的重点放在了Gria1基因元件的5′-UTR和3′-UTR区域。重要的是，对来自20岁猕猴海马组织裂解物进行circGRIA1的ChIRP时，回收到大量其亲本基因5′-UTR的PCR产物，尤其是比较于10岁猕猴海马组织。随后，对Gria1 5′-UTR的RT-PCR产物进行Sanger测序，表明cicGRIA1可以与其亲本基因的启动子区域相结合。值得注意的是，体外培养的胎儿猕猴海马神经元中过表达/敲低circGRIA1会显着增加/降低其与亲本基因5′-UTR的互作。

为了确定circGRIA1与其亲本基因启动子区域的结合是否影响其转录，将过表达Gria1 5′-UTR的pGL4.11载体与敲低circGRIA1的pLCDH-ciR或过表达circGRIA1的Tet-on circRNA载体，一起转染到不表达circGRIA1的SH-SY5Y 细胞中，24小时后，检测萤光素酶活性。作者发现荧光素酶活性的相对水平与之前的假设相符，即circGRIA1通过与Gria1基因启动子竞争性结合，而显著抑制Gria1基因转录。最后，使用RNA-DNA双荧光原位杂交（FISH），作者进一步验证了核circGRIA1与Gria1基因座的共定位，且DIV28的共定位显著高于DIV14。

图3  circGRIA1对其亲本基因座的调控

4、CircGRIA1可以负向调节Gria1 mRNA的表达

作者使用BASEscope和RNAscope ISH来探索DIV14和DIV28的雄性胎儿猕猴海马神经元中circGRIA1和Gria1表达水平之间的相关性。接下来，作者设计并合成了靶向CircGRIA1环化位点的siRNA，将其与对照载体转染至DIV5海马神经元中。BASEscope 和BASEscope ISH信号平均强度的分析表明，在转染siRNA病毒颗粒的DIV28神经元中，circGRIA1和Gria1 mRNA表达分别显着降低和增高，而两者在敲低circGRIA1的DIV14神经元中均无变化，这可能由于circGRIA1水平在DIV14神经元中本身就较低。由于circRNA非常稳定，因此作者希望排除年龄相关的circGRIA积累对circGRIA负向调控其亲本mRNA表达的影响。作者采用了过表达的试验方法，western blot结果显示，过表达circGRIA1会导致DIV28和DIV14组的GluR1 蛋白水平显着降低。

图4  CircGRIA1负向调节Gria1 mRNA表达

5、CircGRIA1可以抑制突触形成

大脑老化会伴随许多化学、生物学和结构的变化，包括突触形成。NMDA和AMPA受体活性是长时程增强和神经活动依赖性突触形成所必需的。为了探索circGRIA1和Gria1表达之间的负相关是否参与衰老状态下突触形成前后的调节，首先，作者在磁共振成像（MRI）的指导下，将靶向circGRIA1的siRNA病毒颗粒显微注射到10岁、20岁雄性和雌性猕猴海马中。6周后，使用BASEscope ISH、RNAscope ISH和qPCR 检测circGRIA1和Gria1的表达水平。结果表明，敲低circGRIA1会导致雄性而非雌性猕猴海马神经元中circGRIA1表达显着下调和Gria1 mRNA表达上调。接下来，作者检查了猕猴大脑中几种突触成分水平与年龄相关的变化。IHC结果显示，比较于10岁猕猴，synapsin-I和PSD9的表达在20岁雌性和雄性猕猴的海马（CA1和DG）中显著下降。尽管VAMP2的变化很小，但其他突触前后成分，包括synapsin-I、 synapto-tagmin-I、syntaxin-2、PSD95和neuroligin-1，均显示年龄相关的下调。

为了确定敲低CircGRIA1是否会阻止突触前囊泡蛋白synapsin-I和突触后蛋白PSD95的下调，作者对死后10岁和20岁的雌性和雄性CircGRIA1敲低猕猴的海马切片进行实验。敲低circGRIA1可以显着增加20岁雄性猕猴海马神经元中synapsin-I的水平，而非20岁雌性猕猴。令人惊讶的是，敲低circGRIA1的20岁雄性和雌性猕猴中PSD95水平几乎没有变化。体外实验与体内实验结果一致，在体外培养的雄性胎儿猕猴海马神经元中，过表达和敲低circGRIA1分别会导致synapsin-I的下调和显著上调，且并没有改变PSD95水平。尽管DIV28的海马神经元中synapsin-I和PSD95的表达显着降低，但在DIV5时，使用siRNA敲低circGRIA1仅会导致DIV28的神经元中synapsin-I表达显著增加，而对PSD95水平没有影响。

图6  敲低CircGRIA1可促进突触形成

6、CircGRIA1负向调节突触可塑性和钙稳态

突触可塑性的动态平衡与AMPA和NMDA受体介导的神经元活动密切相关。微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）的水平取决于形成的突触数量和/或突触前膜的囊泡释放率，因此可用来建模。在平衡状态下，mEPSCs的幅度取决于突触后谷氨酸的反应性或突触前突触小泡的谷氨酸含量，或者两者兼而有之。由于CircGRIA1不仅影响GluR1的表达，而且还调节突触前成分synapsin-I的密度，作者想知道CircGRIA1是否与突触可塑性的动态平衡相关。制备体外培养的胎儿猕猴海马神经元，在DIV5时，分别转染CircGRIA1-siRNA和对照载体。在转染后的不同时间点，追踪mEPSCs频率和幅度的变化。与DIV14相比，DIV28神经元的自发mEPSCs振幅和频率在对照组中正常降低。当在海马神经元中敲低CircGRIA1，会部分恢复自发mEPSCs振幅和频率。接下来，作者探索circGRIA1是否也通过 bicuculline（一种GABAA受体拮抗剂）来操纵神经元活性，进而促进GABAA受体阻滞引起的一系列变化。在DIV28的海马神经元中，bicuculline可以增强其兴奋性神经活动，导致mEPSCs振幅的稳态下降，但频率不变。有趣的是，bicuculline处理后的mEPSCs模式与自发mEPSC模式相似，bicuculline诱导mEPSCs振幅变化不受circGRIA1表达的影响。为了进一步验证上述结果，作者在DIV14和DIV28的海马神经元中诱导了化学LTP(cLTP)，发现雄性神经元中的CircGRIA1水平确实可以影响cLTP和mEPSCs。

年龄相关的神经可塑性缺陷与年龄诱导的钙稳态失衡密切相关。由于AMPA和NMDA受体都需要钙内流来发挥作用，所以钙稳态对神经系统非常重要。大量证据表明，谷氨酸受体信号诱导的钙稳态紊乱可能是大脑老化和阿尔茨海默病生物学中的一个致病因素。因此，作者试图确定CircGRIA1表达水平的增加是否可能在AMPA受体活性依赖的钙稳态紊乱中起到潜在作用。作者使用显微镜荧光计来检测雌性和雄性胎儿猕猴海马神经元中的Fura-2，Fura-2是细胞内钙离子（Ca2+）的特异性荧光指示剂。作者先用谷氨酸然后是100μM环噻嗪（CTZ，一种AMPA受体调节剂，与AMPA受体结合并使之脱敏）处理后，在6至8个神经元组中追踪Fura-2荧光。结果发现，细胞内神经元钙浓度增加并维持在150.9±33.8 nM（约为原始基线的1.5倍）。此外，在谷氨酸盐+CTZ处理后的DIV28的雄性胎儿猕猴海马神经元中，敲低circGRIA1会导致细胞内钙浓度显着增加，几乎恢复到DIV14神经元中的钙水平，其钙离子浓度维持在206.8±28.6 nM（约为原始基线的约4.1倍）。

参考文献

1. Xu K, Zhang Y, Xiong W, et al. CircGRIA1 shows an age-related increase in male macaque brain and regulates synaptic plasticity and synaptogenesis. Nat Commun. 2020, 11(1):3594. Published 2020 Jul 17. doi:10.1038/s41467-020-17435-7

环状RNA(circRNA)在不同物种的神经元中含量丰富，并随着年龄的增长而积累。然而，只有少数circRNA具有功能特征，它们在衰老过程中的作用尚未被揭示。在本篇文章中，作者表征了circRNA与胰岛素介导的寿命延长和衰老之间的功能联系。转录组分析发现，在长寿胰岛素突变果蝇的衰老过程中，circRNA积累减慢。值得注意的是，circSfl在长寿胰岛素突变果蝇中上调，并与胰岛素突变果蝇的寿命延长相关，仅过表达circSfl或其编码的蛋白就足以延长果蝇寿命。

1 在胰岛素突变果蝇的神经元组织中circRNA累积随年龄增长减慢

在各种生物体中，circRNA都会随着年龄的增长而累积，但是circRNA在衰老中的作用还尚不知晓。为了探索circRNA表达随年龄的动态变化，作者对野生型(WDah)果蝇和长寿的三个胰岛素样多肽（dilp 2-3，5）突变果蝇进行全转录水平的深度测序。作者解剖了幼龄(出生后第10天)、中年(出生后第30天)和老年(出生后第50天)果蝇的四个主要成虫组织(脑、有马氏管的肠管、胸部和脂肪体)，以组织特异性的方式研究其衰老过程。结果表明，circRNA表达在果蝇大脑中有很明显的倾向，大多数circRNA是大脑所特有的，在其它组织中不表达，这与之前的报道结果相一致。

接下来，作者探索circRNA表达水平随年龄增长的总体变化。如预期的那样，脑组织中总体circRNA水平随着年龄的增长而累积，而在其它组织中，作者仅观察到非常轻度的累积（脂肪体）、无整体变化（肠管）或circRNA水平略微降低（胸部）。令人惊讶的是，circRNA同样在dilp 2-3,5突变果蝇大脑中累积，但比野生型果蝇大脑中的累积程度低得多，表明随着年龄的增长，circRNA的积累会因胰岛素信号的减少而减慢。作者注意到降低的胰岛素信号转导也会影响其它组织中各个时间点的总体circRNA水平，但是它们并没有一致的变化，如在肠管组织中circRNA水平升高，在胸部组织中circRNA水平降低。总之，作者观察到，不仅在组织特异性方面而且在时间特异性方面，circRNA的表达同样存在显着差异，这表明circRNA在衰老过程中具有重要作用。

图1 衰老过程中长寿胰岛素突变果蝇的组织特异性circRNA表达谱

2 circSfl在不同的长寿胰岛素突变果蝇中上调

接下来，作者寻找独立于宿主基因并特异性地调控dilp 2-3、5突变果蝇的circRNA，因为，这可以表明circRNA的调控是特异性的，而不仅仅是与宿主基因共同发挥作用。大部分差异表达的circRNA是在dilp 2-3、5突变果蝇的大脑和脂肪体内检测到，仅有少数存在于肠管和胸部组织中。作者确定由sulfateless（sfl）基因编码的circRNA circSfl是果蝇体内表征的主要靶标，因为circSfl在果蝇的几乎所有组织和所有时间点都表达并在胰岛素突变果蝇中上调，此外，它还是最强的调控性circRNA之一。接下来，作者进行RNase R处理证实circSfl对RNase R具有抗性。随后，Sanger测序验证了circRNA特异性反向剪接区域的存在，表明circSfl确实是一个环状转录本。

为了验证RNA测序结果，作者使用特异性引物通过qRT-PCR来分析circSfl和源于Sfl基因的两个不同线性转录本（RA和RB）的表达水平，RA和RB的不同之处在于RA基因的5’非翻译区(UTR)有一个37bp长的功能未知的外显子。结果表明，在dilp 2-3、5突变果蝇的所有组织和时间点中，circSfl的表达均被上调。有趣的是，Sfl RB的表达，而不是RA，与dilp 2-3、5突变果蝇中的circSfl表达模式相关，暗示线性和环状同系物的剪接之间可能存在联系。与之一致的是，circSfl在其它长寿胰岛素突变果蝇中也同样上调：遗传性切除正中神经分泌细胞（MNC），MNC可以产生胰岛素；在肌肉中过表达dFoxo。在这两种情况下，circSfl的表达均被上调，而非线性转录本Sfl RA和RB。有趣的是，MNC切除果蝇中circSfl的上调也取决于dFoxo，它是MNC切除果蝇延长寿命所需的胰岛素信号传递的下游转录因子。在野生型和MNC切除果蝇中，敲低dFoxo均会下调circSfl的表达。值得注意的是，在饲喂可延长寿命的雷帕霉素果蝇中circSfl表达并没有增加，在饮食限制下的果蝇甚至在mth¹突变果蝇中circSfl表达也仅仅是轻微下调。这些结果表明，circSfl在长寿胰岛素突变果蝇中特异性地上调，而这种上调取决于转录因子dFoxo，它是减少胰岛素信号传递以延长寿命所必需的。

图2 circSfl以dFoxo依赖性的方式在长寿胰岛素突变果蝇中上调

3 构建circRNA过表达突变体

下一步，作者的目标是构建circSfl的过表达突变体。作者测试三种不同构建体的circSfl过表达能力：circSfl-exon（仅含有产生circSfl的外显子）、circSfl-1,000（circSfl外显子加上两侧1,000 bp的内含子）和circSfl-inverted（circSfl-inv；合成circSfl外显子上游1000 bp内含子的反向互补序列，并人工的添加到circSfl外显子下游），仅仅只有circSfl-inv构建体可以显著过表达circSfl，而Sfl RA和RB的表达水平并没有受到很大影响，以下将circSfl-inv称为circSfl过表达突变体。为了验证这种过表达系统是否也适用于其它circRNA，作者为circBtsz合成了类似的过表达构建体。与circSfl的结果一致，circBtsz-inv突变体同样强烈过表达circBtsz，而circBtsz-exon和circBtsz-1000均不影响circBtsz的表达水平。总之，作者利用工程性反向互补的侧翼内含子，来在果蝇体内强烈过表达特异性的circRNA。

4 过表达circSfl可以延长果蝇寿命

由于circSfl在不同的长寿胰岛素突变果蝇中持续上调，作者想知道仅仅过表达circSfl是否足以延长果蝇寿命。在低胰岛素条件下，circSfl在果蝇的四个测试组织中均上调，其中，在肌肉和脑组织的上调最显著。因此，作者选择神经元特异性的elav-Gal4和肌肉特异性的MHC-Gal4来驱动特定组织过表达circSfl，并选择da-Gal4来普遍过表达circSfl。引人注目的是，在这三个Gal4驱动程序中过表达circSfl均会导致雌性果蝇寿命显著延长。在肌肉组织、神经元和普遍过表达circSfl中，果蝇的平均寿命分别提高了12%、4.5%和15%。其中，普遍过表达circSfl的果蝇的寿命延长最为显著。相比之下，雌性果蝇体内NP1-Gal4驱动肠道特异性过表达circSfl或雄性果蝇中普遍过表达circSfl并没有显着改变果蝇的寿命，表明circSfl对寿命的延长存在组织特异性和性别特异性。值得注意的是，qRT-PCR表明，在上游激活序列（UAS）对照果蝇（UAS-circSfl /+）中circSfl的表达较低，而这些果蝇与Gal4对照果蝇相比寿命并不长，这表明在野生型背景下，circSfl的强表达是延长寿命的必要条件。有趣的是，尽管过表达circSfl会延长果蝇寿命，但与胰岛素突变果蝇不同，它们并未显示出抗压或爬升能力的增强、果蝇较小以及发育迟缓。这提示circSfl调节一种机制，该机制专门影响寿命，但并不影响胰岛素信号减少的其它多效性后果。综上所述，作者的研究表明，circRNA在衰老过程中发挥重要作用，它可以延长寿命，这有助于了解circRNA在体内的功能。

图3 过表达circSf1可延长寿命

5 胰岛素介导的寿命延长依赖于Sfl-RA和circSfl

由于过表达circSfl足以延长果蝇寿命，作者想知道circSfl是否也是延长胰岛素突变果蝇寿命所必需的。因此，作者设计并合成了靶向circSfl反向剪接区域的siRNA来敲低circSfl。然而，所测试的三个siRNA均不能显著降低circSfl的表达，也不能影响线性转录本RA和RB的水平。这可能是因为，siRNA设计非常局限于circRNA所特有的反向剪接区域，导致设计的siRNA并不是总能够成功地敲低。值得注意的是，作者发现在长寿dilp 2-3,5突变果蝇中，circSfl的反向剪接与线性Sfl RB转录本（而非RA）的选择性剪接相关。随后，作者想要通过影响宿主基因的选择性剪接来改变circSfl的表达。为了阐明circSfl反向剪接和线性Sfl RB转录本选择性剪接之间的联系，以及是否可以通过改变选择性剪接来影响circSfl表达，作者通过CRISPR-Cas9生成了Sfl^∆ex2突变果蝇，Sfl^∆ex2突变果蝇在Sfl 5’UTR上缺失约250 bp，包括37 bp长的外显子2，这是Sfl RA所特有的。因此，Sfl^∆ex2突变果蝇仅表达Sfl RB。qRT-PCR表明，在Sfl^∆ex2和dilp 2-3，5突变果蝇中，总的线性Sfl转录本水平并没有受到影响，正如预期的那样，在Sfl^∆ex2突变果蝇中检测不到Sfl RA，但是Sfl RB的表达却增高了4倍以上，额外地弥补了Sfl RA的缺失。此外，在Sfl^∆ex2突变果蝇中circSfl的表达降低了50％，而在dilp 2-3，5突变果蝇的基础上，Sfl^∆ex2突变会消除circSfl表达的上调。这些结果表明，circSfl 在dilp 2-3,5突变果蝇中的上调取决于Sfl RA，并证明circSfl的反向剪接和线性Sfl转录本的选择性剪接之间确实存在联系。

Sfl^∆ex2突变体可用作circSfl敲低，因为在这些突变体中circSfl的表达有所降低。因此，作者表征了Sfl^∆ex2突变果蝇以及Sfl^∆ex2和dilp 2-3,5双突变果蝇，以测试Sfl^∆ex2和dilp 2-3,5之间的遗传上位性。有趣的是，虽然Sfl^∆ex2单突变果蝇显示出正常的产卵行为，但在Sfl^∆ex2和dilp 2-3,5双突变果蝇中，dilp 2-3,5介导的产卵减少得以部分恢复。同样，较小的dilp 2-3,5突变果蝇部分被Sfl^∆ex2和dilp 2-3,5双突变恢复，这表明dilp 2-3,5突变果蝇的繁殖力和大小表型部分取决于Sfl RA和circSfl。相反，Sfl^∆ex2突变果蝇发育延迟，与dilp 2-3,5突变果蝇相比，Sfl^∆ex2和dilp 2-3,5双突变果蝇的发育时间更长，表明发育延缓是受独立的机制调控。最后，Sfl^∆ex2和dilp 2-3,5双突变果蝇的寿命显著降低，相比于dilp 2-3,5突变果蝇。总之，作者证明了果蝇的减小大小、降低功能性和延长寿命，而不是延迟dilp 2-3,5突变果蝇发育，取决于Sfl RA和circSfl。

图4 circSfl的反向剪接取决于上游非编码外显子的存在，这对于胰岛素突变介导的寿命延长至关重要

6 circSfl可以被翻译和动态调节

作者已经证明了circSfl在体内的功能，过表达circSfl足以延长果蝇寿命，并且circSfl的产生与宿主基因的选择性剪接相关。然而，circSfl的分子功能仍然未知。一些circRNA被认为可以海绵吸附microRNA(miRNA)，例如，人类CDR1as含有大约70个miR-7的结合位点。相反，在circSfl序列中，作者只鉴定出可以与9种不同miRNA相结合的10个miRNA结合位点，这与果蝇的其它circRNA相比，结合位点相对较少，因此circSfl不太可能充当miRNA海绵。最近有研究表明，当某些circRNA携带其宿主基因的起始密码子并在反向剪接连接区域后存在终止密码子时，它们就可以被翻译成蛋白质。而circSfl正好满足这两个条件，表明它具有蛋白编码潜力。如果circSfl可以编码蛋白质，那么它与传统线性转录本编码的Sfl全长蛋白有相同的N端，包括完整的跨膜结构域，但缺少Sfl全长蛋白C端的酶活性结构域。为了确定circSfl RNA转录是否与其翻译机制相关，作者分析了circSfl在多核糖体谱中的存在情况，并与野生型和dilp 2-3，5突变型脂肪体的总RNA测序结果进行比较。作者观察到，包括宿主基因ATG起始密码子的circRNA在多核糖体中富集；例如，circCamKI、circPkn和circPdk1。此外，在野生型和dilp 2-3，5突变型脂肪体中，circSfl是多核糖体最富集的circRNA之一。

为了测试circSfl是否真的在体内编码蛋白，作者使用CRISPR-Cas9生成FLAG：：Sfl突变果蝇。将FLAG标签插入内源性Sfl基因，在N末端标记宿主基因生成的全长Sfl蛋白，以及可能由circSfl产生的蛋白。使用western blot分析FLAG :: Sfl突变果蝇，作者观察到两个不同的条带，分别对应于分子量约110 kDa（Sfl全长）和25 kDa。根据序列，circSfl ORF（包括FLAG标签）翻译会产生24.75-kDa的蛋白。但是，25kDa的条带也可能来自未知的较短的Sfl异构体或Sfl蛋白降解产物。为了排除这两种可能，作者构建一个仅过表达FLAG标记的circSfl，且不改变FLAG标记的全长Sfl蛋白水平的突变体（称为FLAG :: circSfl）。Western blotting实验表明，过表达FLAG :: circSfl会导致25 kDa的条带加深。此外，作者注意到，与FLAG :: Sfl突变果蝇相比，该蛋白带在SDS-PAGE上的移动速度更快，表明该蛋白的尺寸较小，或是来自FLAG :: Sfl突变果蝇的蛋白具有不同的翻译后修饰。为了进一步证实该蛋白条带确实对应于circSfl编码的蛋白，而不是传统的蛋白降解产物。作者使用UAS-Sfl果蝇，具有N端血凝素（HA）标签并可以表达Sfl的cDNA，它可以生成线性Sfl转录本，而非circSfl。蛋白质印迹分析显示，只有一个蛋白条带与Sfl全长蛋白相对应，即使在elav-Gal驱动的过表达Sfl果蝇中，也没有观察到25 kDa的条带。

作者试图推测circSfl蛋白可能在胰岛素介导的寿命延长中起作用。蛋白印记实验显示，circSfl蛋白水平确实在dilp 2-3,5突变果蝇中上调。最后，为了确定circSfl编码的蛋白是否足以延长果蝇寿命，作者构建了一个从线性转录本中过表达circSfl ORF的转基因果蝇系。值得注意的是，线性circSfl ORF的普遍表达显着延长了雌蝇寿命。因此，多条证据表明circSfl可以编码蛋白，并且该蛋白足以延长果蝇寿命。

图5 circSfl编码的蛋白在胰岛素突变果蝇中上调

7 Sfl的神经元特异性过表达可以延长果蝇寿命

如果circSfl编码小蛋白，则该蛋白与传统线性转录本编码的Sfl全长蛋白有相同的N端。Sfl线性转录物可以编码一个N-脱乙酰基酶/ N-磺基转移酶（Ndst），该酶通过高尔基体中N-乙酰氨基葡糖（GlcNAc）的N和6-O位置的硫酸化催化硫酸乙酰肝素（一种糖胺聚糖）的合成。有趣的是，circSfl ORF覆盖了Sfl的完整胞质N末端以及疏水性跨膜结构域，但缺乏对硫酸乙酰肝素合成重要的光酶结构域。由于过表达circSfl蛋白可以延长果蝇寿命，所以作者接下来测试过表达Sfl全长蛋白是否也影响果蝇寿命。作者分别在UAS-Sfl转基因果蝇的肌肉、肠道和神经元中过表达Sfl，发现在肌肉或肠道中过表达Sfl不会影响果蝇寿命，而普遍过表达Sfl对于果蝇的寿命是有害的。然而，使用elav-Gal4驱动雌性果蝇神经元特异性地过表达Sfl，会使其寿命延长约15％。与过表达circSfl的结果相一致，过表达Sfl并没有增加雄性果蝇的寿命。令人惊讶的是，在dilp 2-3、5突变果蝇中，神经元特异性过表达Sfl会降低果蝇寿命，指出Sfl和dilp 2-3,5之间在遗传上存在相互作用。类似于circSfl过表达突变体，作者在过表达Sfl的果蝇中并没有观察到饥饿压力抗性、攀爬能力、体重或发育的任何差异。相比之下，作者观察到da-Gal4驱动普遍敲低Sfl在幼虫后期的发育是致命，而在成虫阶段会导致寿命缩短。这些结果表明，circSfl和Sfl既有相似功能，又有独立作用，这与circSfl蛋白存在Sfl全长蛋白相同的完整胞质N末端和跨膜结构域，在高尔基体中缺乏C末端的观察结果相一致。

图6 神经元特异性过表达Sfl可以延长果蝇寿命

8 Dally作为Sfl延长寿命的下游靶标

Sfl可以介导硫酸乙酰肝素的合成，果蝇中存在四种Sfl靶向的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖：Dally、Dally-like（Dlp）、Syndecan（Sdc）和Perlecan。为了验证Sfl是否通过硫酸乙酰肝素蛋白聚糖来延长寿命，作者在神经元中过表达Dally、Dlp和Sdc。令人惊讶的是，只有过表达Dally对寿命的影响与过表达Sfl对寿命的延长趋势相一致，表明Dally可能是过表达Sfl延长寿命的下游靶标。为了进一步验证，作者进行遗传上位实验，并使用RNAi技术来敲低过表达Sfl果蝇中的Dally。结果表明，敲低Dally废除了Sfl诱导的寿命延长，这表明Dally是Sfl调节寿命的重要的下游靶标。总之，本研究表明在胰岛素突变果蝇中circSfl和Sfl的线性剪接被改变，并且过表达circSfl或Sfl可以以组织特异性的方式延长寿命。

图7 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Dally介导Sfl诱导的寿命延长

参考文献[1]：Weigelt CM, Sehgal R, Tain LS, et al. An Insulin-Sensitive Circular RNA that Regulates Lifespan in Drosophila [published online ahead of print, 2020 Jun 19]. Mol Cell. 2020;S1097-2765(20)30396-8. doi:10.1016/j.molcel.2020.06.011

环状RNA（circRNA）是RNA生物学领域中崭露头角的内源性RNA，在正常发育过程中的时间特异性和组织特异性对临床疾病具有重要意义。但是，尚未报道circRNA与胚胎肺发育的关系。小鼠胚胎发育与人类胚胎发育相似，是最常用的胚胎发育模型之一。因此，本研究对小鼠胚胎发育的四个关键阶段进行了circRNA测序和肺组织分析，检测时间特异性和组织特异性表达的circRNA，推测它们在肺相关疾病的潜在作用。

图1 样品收集和分析

作者通过比较四个时期circRNA的表达水平，共鉴定了1,735个circRNA，选择520个差异倍数大于2，p value小于0.05的circRNA进行下一步分析。

图2 通过circRNA-seq技术在胚胎发育的四个不同阶段检测所有circRNA

研究表明，circRNA的大多数功能与宿主基因有关。为进一步阐明差异表达的circRNA的潜在功能，作者对circRNA的亲主基因进行了GO分析和KEGG途径分析。在KEGG通路分析中，鉴定到circRNA与Hippo、PI3K-Akt、Wnt、MAPK和TGF-β信号通路以及小细胞肺癌有关。

图3 520个差异表达circRNA的KEGG分析和GO分析

为证实测序结果的可靠性，通过qRT-PCR验证了13个差异表达的circRNA中的六个（circGalnt18、circAlg12、circFilip1、circTtn、circPtprm和circNcoa3）。qRT-PCR结果证实circGalnt18、circAlg12、circFilipl1、circPtprm、circNcoa3和circTtn的差异表达与测序结果一致，表明circRNA-seq结果的可靠性。

图 4 验证circRNA-Seq数据

研究报道，circRNA可以作为miRNA海绵来调节基因表达。因此，作者预测了TargetScan和miRanda数据库中circRNA的下游miRNA结合位点，发现520个差异表达circRNA理论上均具有miRNA结合位点，但需要进一步研究。

图 5 CircRNA–miRNA相互作用网络

本研究通过对小鼠胚胎肺的4个不同阶段样品进行circRNA-seq，鉴定差异表达circRNA，并通过定量PCR技术验证circRNA的表达变化。随后通过分析其亲本基因的GO分析和KEGG通路分析，以及circRNA-miRNA-mRNA网络，预测胚胎胚相关circRNA的功能，为进一步研究circRNA在胚胎肺发育过程中的作用提供理论依据。

参考文献

Zhang, M. J., Yin, J. W., Wu, J. H., Gu, J., Yuan, C. Y., Miao, H. J., & Yu, Z. B. (2020). Circular RNAs are abundant and dynamically expressed during the embryonic lung development of C57BL/6 mice. Heliyon, 6(3), e03437.

近日，柏林医学系统生物学研究所的Nikolaus Rajewsky教授在Cell Reports杂志（IF=7.815，中科院1区）上发表了一篇题为‘A Highly Conserved Circular RNA Is Required to Keep Neural Cells in a Progenitor State in the Mammalian Brain’的文章，鉴定一个高度保守的circRNA，对于维持神经祖细胞库是必需的。

本文研究的是由SLC45A4的第一外显子产生的circRNA， circSLC45A4，该circRNA在人类和热带非洲爪蟾之间高度保守。在妊娠第22周时人类胚胎额叶皮层中鉴定所有的36,408个circRNA中，circSLC45A4的circRNA：mRNA比率（circRNA表达比mRNA高47倍）排名第六，表明circSLC45A4在神经发育中的重要作用。PhyloPscore评估发现，形成circSLC45A4的外显子比该基因的第8个外显子更保守。

图1 circSLC45A4在人类胚胎额叶皮层中保守且高度表达

SH-SY5Y细胞是广泛用于研究神经元分化的人类细胞系。通过细胞分离实验，发现circSLC45A4主要定位于细胞质中，而mRNA存在于核和线粒体中。随后，作者使用三种靶向circSLC45A4的siRNA敲降SH-SY5Y细胞中的circSLC45A4水平，结果，与非特异性siRNA相比，circSLC45A4表达水平下调60%-99%。而参与神经元活动的基因NOTCH1、PAX6和ASCL1，以及标记神经元新生或成熟基因TUBB3、GABBR1和VGLUT1的表达水平上调2至14倍，表明仅敲降circSLC45A4就足以诱导自发性神经元分化。另，敲降circSLC45A4后，SH-SY5Y细胞的神经突长度增加。为了确保这些反应不是由应激反应引起的，对其他无关但相似表达的circVAPA、circCPSF6和circZNF609采用了相同的敲降方法，未发现与神经元分化有关的影响。

图2人神经元细胞系SH-SY5Y细胞中circSLC45A4的敲降导致自发分化

随后作者对敲降circSLC45A4的SH-SY5Y细胞进行转录组测序，证实了其他神经元基因PRKCA、PLXNB2、BSN、SEMA5B和SHANK1显著上调。GO功能分析表明敲降circSLC45A4后，差异表达基因主要与细胞粘附和组蛋白甲基化相关。

接下来，作者研究了circSLC45A4在小鼠大脑发育过程中的表达，发现circSLC45A4在成年鼠脑中表达最高，但在胚胎发育第16.5天和出生后第3天达到峰值。原位杂交表明，跨所有皮质层均可检测到circSLC45A4和mRNA的表达。为了区分circSLC45A4和SLC45A4的作用，将带有荧光标记的circSLC45A4特异性的shRNA和mRNA SLC45A4特异性的shRNA分别注射到E13.5小鼠胚胎的心室中，发现敲降circSLC45A4而不是敲降SLC45A4后，脑室下区域SVZ的细胞基础祖细胞BP大量减少，顶细胞AP显著增加。Tbr^{2 +}细胞仅在心室区（VZ）中受到显著影响，而在脑室下区域SVZ中则没有受到显著影响，表明敲降circSLC45A4 损害了细胞从AP转变为BP。

图3 circSLC45A4的敲降损害了发育中小鼠皮层的基础祖细胞库

随后，作者借助RNA-seq数据验证了敲降circSLC45A4后基础祖细胞BP的耗竭，以及Cajal-Retzius细胞的增加。

图4单细胞RNA-Seq数据确认了基础祖细胞BP的耗竭和Cajal-Retzius细胞的增加

参考文献

Suenkel, C., Cavalli, D., Massalini, S., et al. 2020. A Highly Conserved Circular RNA Is Required to Keep Neural Cells in a Progenitor State in the Mammalian Brain. Cell Reports, 30(7), 2170-2179.

线性RNA的m⁶A修饰研究比较系统全面，已知在mRNA中，m⁶A修饰可以调控RNA的转录和可变剪切，高级结构，出核，稳定性和翻译，存在组织和疾病特异性的修饰状态变化。这些现象大部分在circRNA中有类似的发现，但关于m⁶A与circRNA的生成和高级结构的关系此前一直没有相关的报道。本文的报道表明m⁶A修饰也可以调控circRNA的生成，增加了对m⁶A修饰在circRNA中功能的认识。

此前，已发表的circRNA的m⁶A修饰的功能主要包括：

m⁶A可以启动circRNA的翻译（推荐阅读：重磅！m⁶A修饰促进环状RNA翻译）

circRNA的m⁶A修饰存在细胞和疾病特异性（推荐阅读：重大发现：circRNA存在细胞特异性的m⁶A修饰；BioRxiv：HPH模型中circRNA的m⁶A修饰）

m⁶A介导circRNA的降解（推荐阅读：m⁶A介导mRNA和circRNA的降解）

m⁶A介导circRNA出核（推荐阅读：circRNA的m⁶A修饰再发一篇Nature Communications文章）

本文报道发现在精子发生过程中减数分裂后的粗线期到圆形细胞的时期会生成大量circRNA，其中一些circRNA的反向拼接位点（junction point）两侧往往携带高水平的m⁶A修饰，而m⁶A经常会富集在mRNA的ORF起始密码子和终止密码子周围。有趣的是，作者发现，近半数的这类circRNA携带较长的ORF，这些ORF的起始密码子被m⁶A修饰，可结合核糖体。作者利用液质联用证明了上百种这类circRNA跨接口ORF的翻译产物。这一发现不仅证明了m⁶A可以介导circRNA的生成，还发现了一种全新的依赖circRNA实现线性RNA丢失后蛋白产物的稳定表达机制。

精子发生过程circRNA表达情况

早期研究发现，精子发生过程中，粗线期以后会出现RNA产物变短和包装进入RNP颗粒的现象，RNA产物变短可能与可变剪切的增加或一些RNA降解机制有关，而RNP颗粒则可以保护一些特殊的mRNA避免被降解，以维持一些重要蛋白的表达。为系统研究精子发生过程中全转录组的变化情况，作者选择粗线期，圆形细胞期和精子延长后的RNA进行全转录组分析和RNase R处理后的circRNA测序分析，结果表明随着精子发生过程的进展，circRNA的丰度呈现增高趋势，而这些circRNA所对应的线性mRNA却是下降的。

图1 精子发生过程中circRNA表达增高 （[1]）

精子发生过程中circRNA生成与m⁶A修饰有关

作者发现随着精子发生过程进展，Alkbh5基因表达下调，Alkbh5基因敲除小鼠中精子发生过程从粗线期，圆形细胞期到精子延长阶段的circRNA表达会大幅增高。Anti-m⁶A RIP-seq测序分析表明，随着精子发生的进展，circRNA拼接位点处的m⁶A修饰呈现增加趋势。

图2 精子发生过程circRNA的增加与m⁶A状态有关 （[1]）

精子发生过程中一部分外显子circRNA带有m⁶A起始密码子的跨接口ORF

进一步分析这些circRNA分子，作者发现它们很多都是从mRNA的CDS区起始密码子和终止密码子周围形成的，这些circRNA的拼接位点更多的倾向于恰好分布在CDS的其实和终止密码子附近，并且这种携带了起始或终止密码子的circRNA随着精子发生的过程而呈现增加的趋势。如果这些circRNA恰好包含了全长的CDS，就有可能存在这样的机制：在精子发生的后期，细胞通过将RNA产物转变成circRNA来弥补由于mRNA大量降解导致的蛋白翻译模板不足，也就意味着在精子发生的后期，一些重要的蛋白是通过形成circRNA来维持其表达状态的。Anti-m⁶A RIP-seq数据表明随着精子发生过程进展，携带m⁶A的circRNA数目增加，并且这些circRNA更倾向于携带来源基因的起始或终止密码子。核糖体测序和分离RNP后测序结果表明 ，随着精子发生进展，Polysome结合的circRNA数目有所增加，结合着RNP颗粒中的circRNA也显著增多。这是否预示着，circRNA也可以存在通过RNP结合并逐步释放进行蛋白的表达？

图3 一部分circRNA携带m⁶A修饰的跨接口ORF （[1]）

精子发生过程中circRNA可包装进入RNP并可释放后结合核糖体

基于上述的发现，作者分析了精子发生的不同阶段circRNA结合在RNP中和结合核糖体的情况，结果显示随着精子发生的进展，更多的circRNA会从RNP颗粒中释放出来，结合核糖体，而它们所对应的线性RNA则逐渐被降解。ATAC-seq分析表明和粗线期相比，圆形细胞期的染色质松散性更低。

图4 精子发生过程中circRNA可包装进入RNP并可释放后结合核糖体（[1]）

ALKBH5 和METTL3调控精子发生过程RNA m⁶A修饰

Alkbh5敲除小鼠中，粗线期，圆形细胞期和精子延伸期的细胞中circRNA的丰度一直很高，但野生型小鼠中circRNA的丰度是伴随着精子发生过程逐步增高的。Alkbh5敲除小鼠中，相关circRNA的m⁶A水平显著高于野生型。而Mettl3敲除的小鼠中则呈现相反的趋势。

图5 ALKBH5 和METTL3调控精子发生过程RNA m⁶A修饰（[1]）

精子携带大量保守性较高的circRNA

作者发现精原细胞中circRNA的丰度甚至高于精母细胞和精子细胞。精原细胞中胞浆小滴（cytoplasmic droplets）也发现含有大量的circRNA分子。通路富集分析表明，胞浆小滴中携带的circRNA来源基因主要精子运动，精子能量代谢等，而在成熟精子中所携带的circRNA来源基因主要是组蛋白和DNA修饰相关的基因。有趣的是，作者还分析了精子头部和整体精子中circRNA丰度的差异，结果表明精子的头部仅携带了不到三分之一的总circRNA。作者还发现相对于年老的小鼠精子，年轻小鼠的精子中携带更多的circRNA。精子携带的circRNA中有30-50%在多种物种中高度保守。在人的精子标本中，高受孕率的精子携带更多的circRNA，也有相对于mRNA更高的丰度。

图6 精子携带高保守性的circRNA （[1]）

精原细胞中一些circRNA可被翻译

上述的circRNA分子一方面携带了m⁶A修饰，另一方面也有证据可以结合核糖体，因此有理由推测这些circRNA分子可被翻译，为进一步证明这一问题，作者通过circRNA的接口位点序列生成了虚拟肽段序列库，并分析了蛋白质谱图，找出了一些有质谱证据支持的跨接口翻译产物。这种跨接口翻译产物伴随着精子成熟过程而升高，进一步说明精子成熟过程，circRNA的翻译可能起到重要的作用。

图7 精子成熟过程可翻译circRNA的鉴定 （[1]）

本文的报道填补了m⁶A修饰与circRNA生成相关性研究的空缺，推动了circRNA研究的进展。本文所描述的机制还可能对精子发生过程中基因表达的机制提供新的思路和认识，也暗示circRNA作为一种功能性的分子，在生命活动过程乃至一些病理发生发展过程中的重要意义。

参考文献

1. Chong Tang, Y.X., Tian Yu, Na Liu, Zhuqing Wang , Rebekah J. Woolsey, Yunge Tang, Xinzong Zhang, Weibing Qin, Ying Zhang, Ge Song, Weiwei Zheng, Juan Wang, Weitian Chen, Xiongyi Wei, Zhe Xie, Rachel Klukovich, Huili Zheng, David R. Quilici and Wei Yan, m6A-dependent biogenesis of circular RNAs in male germ cells. Cell Research, 2020.

本文分析了脂肪组织中转录组的变化情况，找到了41种变化显著的候选circRNA分子，QPCR分析验证后表面脂肪分化过程往往伴随着circRNA的下调。干扰RNA实验表明circTshz2-1和circArhgap5-2在脂肪分化过程中具有功能。circArhgap5-2在脂肪相关基因表达中发挥重要功能，参与维持脂肪相关基因的表达。人类同源分子circARHGAP5-1也在脂肪组织分化中发挥重要作用。

脂肪组织circRNA测序分析

从人体内脏网膜和皮下脂肪组织及小鼠附睾和腹股沟脂肪组织中分离总RNA，去核糖体后测序。人体组织中共测得6925种circRNA，小鼠测得2380种。

图1 脂肪组织转录组测序分析 （[1]）

相关circRNA验证

人和小鼠获得的数据进行比对分析，共有120种circRNA是人与小鼠均存在的保守分子。选择人或小鼠脂肪组织中表达丰度最高的各20个，脂肪组织特异性的circRNA分子15个，去除总长度小于90bp的，最终剩余41种circRNA分子进行QPCR和Sanger测序验证。其中37种可以得到验证确认。作者进一步选取了12种circRNA分子在小鼠不同的组织中QPCR分析了它们和对应线性mRNA的表达情况，结果显示这12种circRNA均呈现出较高的脂肪组织特异性的表达特征，但它们对应的线性RNA的组织特异性稍弱。作者还通过分离胞质与核组分，分析了所选取的circRNA分子在胞质与核中的分布情况。

图2 circRNA验证 （[1]）

脂肪分化过程中相关circRNA的验证分析

为分析这些circRNA分子是否参与脂肪组织的生成，作者选择脂肪前体细胞体外分化体系进行验证。结果表明候选的circRNA分子中有31种circRNA会伴随着脂肪分化过程而显著升高。相关性分析表明所有这些circRNA分子的表达都与对应的线性RNA的表达状态相关。体内，高脂饮食处理后，脂肪组织中绝大部分circRNA呈现出下调变化趋势， 37个circRNA分子中有33个呈现下调，其中19种的变化是统计显著的。有趣的是，在腹股沟脂肪组织样本中，高脂饮食导致的circRNA和对应线性RNA的变化趋势呈现出有趣的变化状态，很多分子表现出相反趋势的变化。说明脂肪生成过程中circRNA的形成不完全是对应线性基因表达变化所导致的。过度肥胖往往导致单核细胞等进入脂肪组织，释放TNFα是等促炎症因子。因此作者分析了TNFα处理对circRNA和对应基因的影响情况，结果表明TNFα处理的确能诱导这些circRNA的下调，但其变化与对应线性RNA的变化并不一致，相关性不高。这些结果表明脂肪组织分化过程伴随着circRNA的变化，这些变化不完全由对应基因的转录变化所导致。

图3 脂肪组织分化过程中相关circRNA变化分析 （[1]）

circTshz2-1和circArhgap5-2与脂肪分化有关

为分析circRNA是否参与脂肪分化过程，作者基于RNAi，分析了两个circRNA分子，circTshz2-1和circArhgap5-2，这两种circRNA分子对应的线性RNA在脂肪分化过程中变化并不明显，但两个circRNA分子都呈现显著的上调。针对circRNA和线性RNA分别设计siRNA，分析脂肪分化效率。结果表明，circTshz2-1干扰后都显著影响脂肪分化的效率，表现为脂滴数目下降，脂分化相关标志物基因下调。

图4 circTshz2-1与脂肪分化有关 （[1]）

circArhgap5-2干扰后也与circTshz2-1的情况相似，可以显著降低脂肪分化的效率。

图5 circArhgap5-2与脂肪分化有关 （[1]）

circArhgap5-2维持脂肪细胞基因表达

脂肪分化过程中将circArhgap5-2干扰后分析转录组表达变化，GSEA分析表明脂肪代谢和脂分化相关的基因存在显著下调，说明干扰circArhgap5-2后显著影响了这两个通路相关的基因的表达。

图6 circArhgap5-2维持脂肪细胞基因表达 （[1]）

小鼠体内注射circArhgap5-2的shRNA的AAV病毒，QPCR检测circArhgap5-2，测序分析转录组变化情况并进行通路富集分析。结果表明shRNA干扰circArhgap5-2后，脂代谢和脂肪分化相关的基因下调，但炎症相关的通路上调。QPCR检测脂分化相关基因的表达表明脂代谢标志物下调而炎症通路基因上调。

图7 体内circArhgap5-2维持脂肪细胞基因表达 （[1]）

人类circARHGAP5-1调控脂肪分化

人类中与circArhgap5-2同源的是circARHGAP5-1分子，脂肪细胞中干扰circARHGAP5-1也可以导致脂分化相关的标志物基因下调，抑制脂滴的聚集。

有趣的是，作者经过数据分析和实验验证，认为circArhgap5-2不是miRNA sponge分子。从circArhgap5-2的序列中可预测到43种miRNA的66个结合位点，如果circArhgap5-2具有ceRNA的功能，那么干扰之后一定会从对应的miRNA靶基因中得到相关的变化证据。但所有的转录组数据均不支持这一假设。此外，AGO2的RIP实验也没有捕获到circArhgap5-2分子。

此外，作者也分析了circArhgap5-2是否可被翻译的可能，作者未能从脂肪细胞的Ribosome profiling数据中富集到这个circRNA分子。circTshz2-1也没有被捕获到。因此作者也认为这两个circRNA分子被翻译的可能性也比较小。

图8 人类circARHGAP5-1调控脂肪分化 （[1]）

本文分析了脂肪分化相关的circRNA分子，发现了circTshz2-1和circArhgap5-2在脂肪分化过程中发挥重要功能，初步探索了circRNA在脂肪组织分化中的作用。但关于两个circRNA分子如何在脂肪分化过程中发挥作用，两种circRNA分子如何被调控，呈现组织特异性的表达状态还没有清晰的认识，值得继续深入探索。

参考文献：

1. Camille Arcinas , W.T., Wenning Fang, Tresha P. Desai, Diana Chee Siang Teh, Ufuk Degirmenci, Dan Xu , Roger Foo and Lei Sun, Adipose circular RNAs exhibit dynamic regulation in obesity and functional role in adipogenesis. Nature Metabolism, 2019.

文章基于高通量测序在Lgr5+的肠道干细胞（Intestinal stem cells，ISCs)）中分析干细胞特有的circRNA分子，共找到10个circRNA，然后基于shRNA分别干扰后看对ISCs 的类器官形成能力（Organoid formation）影响情况，发现来自Pan3基因第2-5外显子的circRNA （circPan3）能够显著影响CD45+细胞共培养条件下的类器官形成，因此本文将研究分子锁定在circPan3。作者进一步基于circPan3基因敲除小鼠，确认了体内circPan3参与了免疫细胞介导的ISCs自我更新。机制方面，circPan3结合IL-13Rα1的mRNA并促进其稳定，IL13结合并激活下游通路，激活Foxp1的表达，再通过促进β-Catenin入核，参与Lgr5+ISCs的自我更新[1]。本文通过基因敲除模型严谨的证明了circPan3在ISCs自我更新过程中的作用，丰富了对免疫细胞介导的ISCs自我更新作用的认识，对于circRNA的功能研究和ISCs干性机制都具有重要意义[1]。下面让我们首先学习一下作者如何构建circPan3的基因敲除小鼠的，然后再详细了解一下他们如何筛选到这个分子，然后验证其体内功能，如何开展机制研究的：

circPan3敲除模型如何构建的？

小鼠中不存在Alu序列，促进circRNA形成的往往是一些SINE元件，因此作者需要首先确认需要打靶的circRNA是由什么序列介导形成circRNA的。作者的策略是在小鼠的Lgr5+ISCs细胞中通过慢病毒载体构建mini-gene，模拟体内成环的过程。基于这一技术路线，可以通过构建删除特定内含子片段分析介导所感兴趣的circRNA由哪些序列元件介导的。作者就是通过这种技术路线找出了介导circPan3生成的内含子序列，如下图中a所示的#1和#2位置，Northern杂交也证明了删除#2的mini-gene不再表达circPan3。有了这个基础才能设计出专门针对circPan3的敲除方案，作者设计了靶向#2位置的打靶体系，最终获得了准确删除该位点的小鼠，经过鉴定，该小鼠中circPan3被准确敲除，与此同时，Pan3基因的其他转录产物（下图f中靠上侧的一坨）没有受到明显的影响，Pan3蛋白也没有明显的变化。本文的这个circRNA敲除模型非常有意义，为广大同仁设计circRNA的敲除模型提供了难得的参考依据，非常值得学习。

图1 circPan3敲除模型构建策略 （来自[1]，排列有改动）

如何发现circPan3的？

接下来，让我们回到一开始，了解一下作者是如何找到这个circRNA分子以及如何一步步验证其功能和机制的。

肠道是体内细胞更新速度较快的组织之一，小鼠中平均5天可更新一遍。肠道干细胞（ISCs）是这些细胞更新的主要来源。之前的研究表明ISCs可以在免疫细胞刺激的条件下激活自我更新，但相关机制不甚明了。作者通过Lgr5-GFP的小鼠分离肠道干细胞，该模型能够特异性的仅在ISCs中表达GFP，通过流式分选可以获得高纯度的肠道干细胞。高通量测序后发现有10种ISCs显著高表达的circRNA分子。

接下来，作者针对10个circRNA分子分别构建了shRNA载体，分析与ISCs自我更新有关的circRNA分子，一开始在普通的条件下没有一个circRNA分子有显著的表型，然而，在有CD45+细胞共培养的条件下，发现circPan3敲降后显著影响了ISCs形成类器官的效率，其他的circRNA分子均不明显。因此基于这个体外实验，一方面找到了感兴趣的circRNA分子，还同时发现了这个分子发挥功能的条件。

紧接着，作者还验证了circPan3编码潜能，并构建了从circPan3潜在的起始密码子位置插入的RFP荧光蛋白，Western实验证明了所插入的RFP确实可以被翻译。基于这一结果，作者构建了circPan3-RFP的小鼠模型，只有准确成环的circPan3才能发红光，因此成为体内模型中跟踪circPan3表达的有效工具。组织切片和肠道干细胞培养实验表明circPan3主要在肠道干细胞中表达。

图2 circPan3鉴定与体内表达分析 （来自[1]）

如何证明circPan3在体内参与ISCs的自我更新的？

前期的实验表明只有在CD45+细胞共培养的体系中circPan3才参与ISCs的自我更新，那么这个过程该如何在老鼠模型中验证呢？作者首先分析了circPan3敲除老鼠的肠道组织发生什么变化，组织切片表明circPan3敲除后肠绒毛明显变短，肠隐窝数量明显减少，ISCs细胞数目也明显减少，说明circPan3的确与肠道发育有关系。此外，作者还通过小鼠杂交，获得了Lgr5-GFP，Rosa26-lsl−lacZ，circPan3−/− 的小鼠模型，该小鼠中仅在Lgr5+的ISCs中可通过他莫昔芬诱导（TAM）表达Cre酶，Cre酶诱导LacZ表达，可以通过半乳糖苷酶染色准确示踪肠道干细胞的位置。结果表明circPan3敲除的小鼠肠道中ISCs显著减少。射线诱导肠上皮损伤后circPan3敲除的小鼠肠道无法正常修复。Rag1基因敲除的小鼠缺失B细胞和T细胞，硫酸葡聚糖钠盐（DSS）能诱导急性结肠炎。在Rag1基因敲除的小鼠中利用DSS诱导肠炎，然后移植体外培养的Lgr5+的ISCs类器官可以缓解该症状，但circPan3敲除小鼠来源的ISCs相对于circPan3正常细胞和PBS对照组，体重恢复明显降低。这说明免疫系统异常的小鼠中circPan3也不能有效发挥作用。

图3 circPan3敲除小鼠中ISCs减少 （来自[1]）

circRNA发挥功能主要的机制包括竞争性结合miRNA，结合蛋白复合物及直接翻译多肽等，作者构建了将预测的ORF起始密码子突变为CTG的小鼠模型，发现没有明显的肠道干细胞异常表型。又通过与Rag1−/−，Il2rg−/−双敲除小鼠杂交（该小鼠B细胞，T细胞，NK细胞和先天性淋巴细胞（ILCs细胞）均不能正常发育）。组织切片分析表明杂交后的小鼠circPan3野生型和敲除小鼠的ISCs均显著减少，说明circPan3参与ISCs的自我更新依赖于CD45+的免疫细胞。

circPan3发挥功能的机制是什么？

为分析circPan3调控ISCs自我更新的机制，作者首先通过RNA-seq分析了circPan3敲除与否的ISCs中基因表达状况，分析表明circPan3敲除后有741种基因显著下调，870种基因显著上调（变化大于2倍）。作者挑选了敲除后下调最显著的10个基因，构建shRNA载体，在野生型ISCs中分析与自我更新有关的基因，最后发现了IL-13Rα1在干扰敲降后能明显抑制ISCs的类器官形成速率。组织切片中染色分析表明IL-13Rα1往往在Lgr5阳性的细胞中表达。荧光素酶报告基因实验排除了IL-13Rα1的mRNA在circPan3敲除后表达下调的可能性。RNA Pull-down实验证明circPan3能够结合L-13Rα1的mRNA，EMSA实验进一步证实了这个现象。放线菌素D处理后分析RNA降解实验表明circPan3能够促进L-13Rα1的mRNA稳定性。作者同时还做了突变分析，表明突变后circPan3不再具有结合L-13Rα1的mRNA的能力。

图4 circPan3结合IL-13Rα1的mRNA促进其稳定性 （来自[1]）

利用捕获IL-13Rα1的mRNA的探针进行RNA Pull-down实验，表明在circPan3敲除的ISCs中富集了一种蛋白，Ksrp。Western和突变实验验证了Ksrp与circPan3及IL-13Rα1的mRNA的相互作用。

图5 circPan3结合Ksrp，促进IL-13Rα1的mRNA其稳定性 （来自[1]）

IL-13Rα1是否在ISCs自我更新中起重要作用呢？作者构建了IL-13Rα1的敲除小鼠模型，结果表明IL-13Rα1敲除后ISCs数量显著减少。

图6 IL-13Rα1在ISCs自我更新中起重要作用 （来自[1]）

进一步，作者分析了体内IL13的来源，通过分析不同亚群的细胞，表明2型先天性淋巴细胞（ILC2）是调控肠道干细胞中IL-13Rα1的IL13的主要来源。

图7 ILC2来源的IL-13调控肠道干细胞干性 （来自[1]）

最后作者探究了IL-13调控肠道干细胞干性维持的分子机制，结果表明FoxP1介导了β-Catenin的入核是IL-13介导的circPan3参与的肠道干细胞干性维持机制。

图8 FoxP1介导circPan3介导的肠道干细胞干性维持机制 （来自[1]）

本文通过构建多种基因改造小鼠模型，从参与调控肠道干细胞干性的circRNA分子入手，找到了体内调控ISCs干性的重要分子机制通路，对于circRNA功能研究和肠道干细胞干性维持的基本机制都有重要借鉴意义。

本文的构建circRNA敲除小鼠的技术策略非常值得学习，目前限制circRNA研究的一个重要瓶颈便是无法有效获得特异性敲除circRNA的模型，本文的做法提供了非常好的借鉴。此外，本文的基于circRNA表达RFP的技术也有助于实现原位示踪circRNA的作用，也值得学习。

总之，本文是circRNA功能研究的重要标杆性成果，2019年circRNA研究实现了开门红。

参考文献

1. Pingping Zhu, X.Z., Jiayi Wu, Luyun He, Tiankun Lu, Yanying Wang, Benyu Liu, Buqing Ye, Lei Sun, Dongdong Fan, Jing Wang, Liuliu Yang, Xiwen Qin, Ying Du, Chong Li, Lei He, Weizheng Ren, Xin Wu, Yong Tian and Zusen Fan, IL-13 secreted by ILC2s promotes the self-renewal of intestinal stem cells through circular RNA circPan3. Nature Immunology, 2019.

circRNA一般是来源于母系基因的内含子或者外显子，在结构上属于共价闭合的环状RNA。circRNAs具有作为miRNA的sponge，可结合蛋白，可翻译蛋白等功能。circRNAs作为miRNA的sponge，这是一种反式trans调节基因表达的方式，同时也是大多数研究报道的最常见的调控机制，但circRNA还有可能顺式作用方式调节基因的表达。在大多数肿瘤类型，如肝癌、前列腺癌和直肠癌中存在表达失调的circRNAs。但是以顺式作用方式发挥功能的circRNAs是否会影响β-catenin活化和肿瘤发展，也是有待进一步探究。

顺式作用元件(cis-acting element)存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。顺式作用元件是指与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率。顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”（trans）。

最近华中科技大学同济医学院附属协和医院的童强松研究团队于Cancer Research上在线发表了题为Cis-acting circ-CTNNB1 promotes β-catenin signaling and cancer progression via DDX3-mediated transactivation of YY1的研究，发现编码β-catenin蛋白的ctnnb1基因来源的circ-CTNNB1结合DDX3，促进其与转录因子YY1的相互作用，从而导致YY1的反式活化，以及促进下游与β-catenin活化和肿瘤发展有关的基因表达。敲低circ-CTNNB1表达或者应用阻断circ-CTNNB1-DDX3相互结合的抑制肽可以明显地抑制致癌基因的表达和肿瘤的发生发展，这首次揭示了circ-CTNNB1的致癌作用以及其可能作为未来肿瘤治疗的有效靶点。

1. 作者通过图1A的方法筛选出CTNNB1基因来源的顺式作用的circRNA——circ-CTNNB1，其在胃癌、前列腺癌和直肠癌中表达上调，敲低circ-CTNNB1表达可以降低胃癌细胞AGS中β-catenin的活性。大小为378nt的circ-CTNNB1实际来源于CTNNB1基因的10号内含子，而且耐受RNase R的消化降解，可在大多数肿瘤中检测到circ-CTNNB1的高表达，在发生转移的肿瘤中circ-CTNNB1的表达水平更高，进一步分析显示circ-CTNNB1的高表达与临床病人的存活率低高度相关。

2. circ-CTNNB1的gain or loss of function实验——体外实验验证：接着作者分别在不同类型肿瘤细胞株中过表达或者敲低circ-CTNNB1后，发现其可以分别促进或者抑制细胞存活能力、克隆形成能力和侵袭能力；体内实验验证：过表达或者敲低circ-CTNNB1的癌细胞相应地，在体内成瘤能力增强或者降低，瘤子体积明显增大或者减小，Ki67增殖指数变大或者变小，CD31阳性瘤内微血管形成能力增强或者减弱；在体内尾静脉注射癌细胞后观察肺转移的实验中，过表达或者敲低circ-CTNNB1可以明显促进或者抑制其发生肺转移，导致相应的降低或者提高小鼠存活率的情况。(PS: 本文的circ-CTNNB1过表达载体采用的是吉赛生物的pLCDH-ciR 载体，可转染细胞瞬时表达，也可包装慢病毒构建稳定细胞系，同时表达GFP荧光和 Puromycin抗性基因，可以方便地进行筛选，同时具有过表达效率高、稳定性高和序列环化准确等特点。)

3. 为了解释circ-CTNNB1的致癌机制，作者首先探究了其对母系基因CTNNB1表达的影响。在不同类型肿瘤细胞中，过表达或者敲低circ-CTNNB1表达可以明显上调或者抑制β-catenin的蛋白表达，但并不影响CTNNB1的启动子活性或者转录mRNA水平。而且过表达circ-CTNNB1可以同时上调胞浆和胞核中β-catenin的表达水平；进一步研究发现，过表达或者敲低circ-CTNNB1表达可以明显上调或者抑制β-catenin活性，还可以相应地部分抵消Wnt信号通路抑制剂（XAV939）或者激活剂（WNT3a）的效应。WB实验证明过表达circ-CTNNB1上调β-catenin的蛋白水平主要是因为其降低了β-catenin蛋白的磷酸化水平，抑制了其通过泛素化蛋白酶体途径降解，从而促进其下游靶基因c-Myc和cyclin D1的蛋白表达；另一方面敲低circ-CTNNB1表达上调了β-catenin蛋白的磷酸化水平，该效应可以被WNT3a和GSK-3β抑制剂——LiCl部分抵消。这些结果提示circ-CTNNB1促进β-catenin的表达。

4. circ-CTNNB1发挥功能需要借助什么蛋白partners？RNA-FISH和亚细胞组份分析证明circ-CTNNB1主要定位于胞核中，借助特异性biotin标记的circ-CTNNB1进行RNA pull-down蛋白复合物后再质谱分析蛋白的实验，结合两种细胞株的结果和RBPs数据库筛选出了三种RBPs蛋白，体外再次利用biotin标记的RNA pull-down实验进行二次验证，发现只有DDX3可以与circ-CTNNB1结合，并呈现剂量依赖性；同样地，RNA-FISH、RIP和RNA-EMSA实验均证明了circ-CTNNB1与DDX3相互结合。

5. circ-CTNNB1与DDX3相互结合是否可以调控β-catenin的表达和活性？过表达circ-CTNNB1促进β-catenin蛋白表达的效应，会被DDX3敲低或者DDX3抑制剂RK-33部分抵消。同样地，过表达或者敲低circ-CTNNB1表达促进或者抑制β-catenin活性的效应，也会被RK-33处理或者DDX3过表达所部分抵消。构建不同截短体的DDX3进行体外结合试验，证明了DDX3蛋白的256-315氨基酸（主要是Ia区域的274-279aa）对于circ-CTNNB1的结合是至关重要的。有趣的是，circ-CTNNB1与DDX3两者的表达并不会相互影响。

6. 下一步作者继续深入探究circ-CTNNB1的下游靶基因，通过circ-CTNNB1过表达后RNA-seq分析相关基因的变化，发现1244种基因出现上调，986种基因出现下调；GO分析发现差异表达的基因大部分与Wnt信号通路相关，包括WNT1, WNT3，AXIN2, FZD10和BMP4这五种基因。通过图6B的方法筛选出共同调控这些与Wnt信号通路基因的转录因子，主要是ERG、SP1和YY1。作者发现只有敲低YY1的表达才可以抑制circ-CTNNB1诱导上调的β-catenin表达。Co-IP和BiFC实验均证明了DDX3与YY1相互结合，而且circ-CTNNB1过表达促进，而RK-33处理抑制两者的相互结合。双荧光素酶报告基因实验证明了circ-CTNNB1和DDX3表达对于促进YY1转录活性的重要性，也证明了circ-CTNNB1、DDX3和YY1表达对于促进Wnt信号通路相关的WNT1、WNT2、AXIN2, FZD10和BMP4基因的表达的重要性。

7. 靶向circ-CTNNB1-DDX3结合对肿瘤治疗效应的影响？circ-CTNNB1表达敲低的细胞在小鼠体内成瘤和转移的能力会明显降低，小鼠存活率也都得到明显提高，说明靶向。circ-CTNNB1可以获得很好的抗肿瘤效应。接着作者针对circ-CTNNB1-DDX3结合的重要区域研发了一种细胞通透性的靶向DDX3的长度约为13aa的抑制性肽（DIP-13），通过IP和荧光素酶报告基因实验证明其可以体外明显抑制circ-CTNNB1-DDX3相互结合，同时体外应用抑制肿瘤的生长、增殖和侵袭能力（C,D）。通过分析成瘤体积、肿瘤肿瘤、Ki67增殖指数、CD31阳性的微血管形成和下游基因表达情况等指标，动物体内成瘤实验发现应用该DIP-13抑制肽可以明显抑制小鼠的体内成瘤能力、抑制肿瘤的肺转移情况和提高小鼠存活率。

参考文献

1. Yang F，et al. Cis-acting circ-CTNNB1 promotes β-catenin signaling and cancer progression via DDX3-mediated transactivation of YY1. Cancer Res. 2018 Dec 18. pii: canres.1559.2018. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-18-1559.