2024年5月22日，中山大学附属第三医院肝外科和肝移植中心郑俊以及中国南方医科大学广东省人民医院胃肠外科李勇、郑佳彬、潘子豪团队在Drug Resistance Updates（IF=15.8）发表文章CircPDIA3/miR-449a/XBP1 feedback loop curbs pyroptosis by inhibiting palmitoylation of the GSDME-C domain to induce chemoresistance of colorectal cancer。本研究表明circPDIA3直接与GSDME-C结构域结合，通过阻断ZDHHC3和ZDHHC17的GSDME-C结构域棕榈酰化，增强GSDME-C结构域的自抑制作用，从而抑制细胞焦亡。这些发现为了解circRNA如何通过RNA结合蛋白（RBP）调控细胞焦亡的方式诱导化疗耐药提供了信息，同时也为预防和治疗CRC化疗耐药提供了新的靶点和方向。

circPDIA3在CRC中的鉴定

作者首先对OXA治疗敏感/耐受的CRC患者组织进行RNA测序分析，并结合circRNA在线数据库筛选出hsa_circ_0002891（称为circPDIA3）（图1B-C）。

作者通过Sanger测序鉴定了circPDIA3的特异性剪接位点（图1D）。此外，作者研究了circPDIA3在结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中的表达。数据显示，circPDIA3在CRC细胞系中的表达显著高于NCM460细胞（图1E）。作者通过背靠背引物验证，结合RNase R和放线菌素D处理实验，表明circPDIA3的环状结构相对更稳定（图1F-H）。核RNA和细胞质RNA分析和FISH实验发现cirPDIA3主要定位于细胞质（图1I-J）。

图1 circPDIA3在CRC中的鉴定

CircPDIA3促进了体外化疗的耐药性

作者构建了circPDIA3 敲低载体和过表达载体。结果发现，敲低或过表达circPDIA3对PDIA3的线性表达没有影响（图2A）。CCK-8试验表明，敲低circPDIA3可使OXA耐药细胞对OXA敏感，而过表达 circPDIA3 则相反（图 2B）。同样，克隆形成和EdU检测也表明，circPDIA3的下调增加了OXA耐药细胞对OXA的敏感性，circPDIA3的上调则相反（图2C-D）。此外，凋亡检测证实，在circPDIA3敲低的OXA耐药细胞中，经OXA处理的Annexin V+、PI+单染的细胞的总百分比显著增加，而过表达circPDIA3相反（图2E）。综上所述，体外实验表明，circPDIA3与CRC细胞中的OXA耐药性有关。

图2 CircPDIA3降低了体外结直肠癌对OXA的化学敏感性

CircPDIA3促进了PDX模型和CRC患者的化疗耐药性

作者利用CRC患者组织建立了异种移植（PDX）模型（图3A）。并通过在肿瘤内注射circPDIA3 ASO，观察到ASO-circPDIA3组对OXA的敏感性高于ASO-NC组（图3B-D）。IHC染色证实，Ki- 67的表达随着circPDIA3的减少而降低（图3E-F）。qRT-PCR检测表明ASO-circPDIA3显著抑制了circPDIA3的表达（图3G）。临床研究表明，有复发或转移的CRC患者中circPDIA3的表达高于无复发或转移的患者（图3H）。Kaplan-Meier曲线证实，circPDIA3高表达的患者的DFS率明显低于circPDIA3低表达的患者（图3I）。综上所述，circPDIA3可以作为CRC患者OXA反应的独立预测因子。

图3 CircPDIA3在PDX模型中促进了对OXA的耐药性，并与CRC患者的OXA治疗反应相关

CircPDIA3与GSDME以直接结合的方式相互作用

作者进一步研究与circPDIA3相互作用的蛋白质。RNA pulldown和质谱实验结果显示，GSDME是焦亡途径的关键效应因子，且丰度最高（图4A）。此外，circPDIA3可以与内源性或重组GSDME相互作用，表明circPDIA3与GSDME直接结合（图4B-C）。在GSDME RIP实验中，circPDIA3的显著富集（图4D）。此外，circPDIA3 和GSDME 在CRC细胞中显示细胞质共定位（图4E）。

此外，利用RNA-蛋白相互作用预测（RPISeq）鉴定circPDIA3相互作用蛋白，发现circPDIA3可能直接与GSDME相互作用。然后，使用catRAPID平台，分析circPDIA3核苷酸与GSDME残基之间的精确相互作用（图4F-G）。为了验证GSDME上的circPDIA3结合区域，作者构建了带有Flag标记的全长GSDME及其缺失的突变体（图4H）。RNA pulldown和RIP分析证实，GSDME的C结构域区域，是其与circPDIA3相互作用的关键（图4I-J）。此外，作者还使用HADDOCK2.4上的计算机算法分析了circPDIA3和GSDME的相互作用（图4K）。综上所述，circPDIA3在CRC细胞中与GSDME发生相互作用。

图4 CRC细胞中circPDIA3与GSDME蛋白直接相互作用的鉴定

CircPDIA3增强了GSDME-C结构域的自抑制作用

作者进一步发现circPDIA3敲除的OXA抗性细胞在OXA反应时表现出更明显的细胞肿胀和球囊样肿胀的微观特征，这是焦亡细胞的形态学特征（图5A）。细胞LDH释放实验，结果显示circPDIA3的下调显著增加了OXA耐药细胞向细胞上清中LDH的释放。（图5B）。在OXA耐药细胞中，circPDIA3的敲低减少了激活的caspase-3对GSDME的裂解，而过表达则相反（图5C）。

作者推测circPDIA3可能通过与GSDME-C结构域相互作用，参与调控GSDME的自抑制，从而抑制GSDME的焦亡。Co-IP试验表明，circPDIA3显著增强了GSDME-C-残基结构域的相互作用，且呈剂量依赖性（图5D-E）。同时，circPDIA3的过表达抑制了293 T细胞中的焦亡（图5F-G）。此外，circPDIA3过表达促进了GSDME-C结构域与GSDME-N结构域结合，从而抵消了GSDME-N结构域触发焦亡的活性（图5H-I）。作者进一步将GSDME-C结构域的氨基酸进行细分，进行缺失突变。这些缺失突变表明293 T细胞在circPDIA3存在的情况下发生焦亡（图5J-K）。且减弱了GSDME-N结构域和GSDME-C结构域之间的相互作用（图5L）。综上所述，circPDIA3通过与GSDME-C结合，增加了GSDME-C与GSDME-N的相互作用，从而上调了GSDME的自抑制，而不是持续诱导焦亡。

图5 CircPDIA3促进活化的caspase-3与GSDME的相互作用，诱导焦亡

CircPDIA3抑制的GSDME-C棕榈酰化放大了GSDME-C结构域的自抑制作用

为了检测circPDIA3是否参与了GSDME-C结构域棕榈酰化的调控，作者用脱脂酰化酶抑制剂棕榈酰抑制素B（PalmB）处理293 T细胞。PalmB消除了circPDIA3对GSDME-C结构域棕榈酰化的抑制。相比之下，棕榈酰化抑制剂2-溴磷磷酸酯（2-BP）的处理进一步减弱了GSDME-C结构域的棕榈酰化（图6A）。在circPDIA3存在下，GSDME-C结构域与GSDME-N结构域的相互作用被PalmB阻断，而被2-BP进一步增强，表明circPDIA3负调控GSDME-C结构域棕榈酰化（图6B）。接着作者进一步鉴定了参与调控GSDME-C结构域棕榈酰化的特异性ZDHHC棕榈酰基转移酶，结果发现，ZDHHC3和ZDHHC17可能通过激活293 T细胞中的GSDME-C结构域棕榈酰化来抑制GSDME-C结构域的自抑制（图6C-E）。同样，过表达circPDIA3可以消除ZDHHC3或ZDHHC17对GSDME-C结构域棕榈酰化的促进作用，并提高GSDME-C结构域的自抑制作用（图6D-E）。

棕榈酰化主要发生在4个C残基上，只有当所有四个候选C残基都发生突变（GSDME-C 4CA）时，GSDME-C结构域的棕榈酰化才被消除。当ZDHHC3或ZDHHC17过表达时，GSDME-C结构域的棕榈酰化增强，其自抑制作用减弱，而GSDME-C 4CA没有明显变化（图6F-G）。与预期一致的是，当这四个C残基突变为A残基时，circPDIA3由于无法抑制GSDME-C结构域的棕榈酰化而失去了增强其自抑制作用的能力（图6H-I）。综上所述，circPDIA3通过抑制GSDME-HHC3-和ZDHHC17依赖的GSDME-C结构域的棕榈酰化，增强了GSDME-C结构域的自抑制作用。

图6 circPDIA3对GSDME诱导焦亡活性的自抑制调控

CircPDIA3在体内外发挥OXA耐药促进作用，依赖于与GSDME的结合

基于circPDIA3与GSDME-C结构域的特异性结合区域，进一步探讨circPDIA3是否通过与GSDME-C结构域结合抑制GSDME-C棕榈酰化来促进OXA抗性，作者构建并验证了circPDIA3 突变质粒（circPDIA3-MUT）（图7A-B）。同时，RIP实验证实，circPDIA3-MUT质粒不能与GSDME结合（图7C）。CCK-8检测、集落形成、EdU检测和凋亡检测证实，阻断circPDIA3与GSDME的结合会增加体外CRC细胞对OXA的敏感性（图7D-G）。与野生型circPDIA3相比，转染circPDIA3-MUT的OXA敏感细胞对OXA表现出更明显的细胞肿胀和球囊状肿胀的微观特征，而细胞LDH释放试验显示circPDIA3-MUT显著增加了OXA敏感细胞上清中LDH的释放（图7H-I）。Western blot实验证实突变体circPDIA3恢复了裂解的GSDME-N结构域（图7J）。此外，共免疫共沉淀分析表明，突变体circPDIA3丧失了增强GSDME-C结构域与GSDME-N结构域相互作用的能力（图7K-L）。与预期一致，突变体circPDIA3不能抑制GSDME-C结构域棕榈酰化（图7M）。因此，circPDIA3依赖于与GSDME的结合来促进OXA的抗性。

接下来，作者在小鼠模型中研究了突变体circPDIA3在调节OXA抗性中的作用。结果表明，circPDIA3-MUT组的肿瘤体积和重量明显大于circPDIA3组（图7N-P）。IHC分析显示，circPDIA3-MUT组的Ki-67水平降低（图7Q-R）。血清LDH分析显示，与circPDIA3组相比，circPDIA3-MUT组的LDH释放量减少，这与体外实验结果一致（图7S）。此外，免疫印迹分析显示，circPDIA3-MUT组的GSDME-N增加，证明重新激活焦亡（图7T）。综上所述，circPDIA3 使小鼠细胞对 OXA 处理敏感，并依赖于GSDME的结合。

图7 CircPDIA3依赖于与GSDME的结合来诱导OXA抗性

circPDIA3在CRC中的表达受XBP1调控

由于PDIA3转录驱动circPDIA3的表达，作者推测参与调控PDIA3转录的转录因子可能对circPDIA3发挥类似的作用。作者使用了PROMO数据库和GEPIA数据库预测出XBP1与PDIA3的正相关性最强（图8A-B）。qRT-PCR分析显示，过表达XBP1上调了circPDIA3的表达，而下调XBP1则相反（图8C）。通过分析JASPAR数据库，在PDIA3启动子区域（R1和R2）上发现了两个XBP1结合基序，并据此为这些区域设计了两个引物（P1和P2）（图8D-E）。ChIP-PCR分析结果显示XBP1主要与P1区域的PDIA3启动子结合（图8F-G）。此外，构建野生型（WT）和突变型（MUT）PDIA3序列，荧光素酶报告基因分析显示，XBP1过表达显著增加了WT的荧光素酶活性，而XBP1敲低得到相反的结果（图8H-I）。综上所述，XBP1通过与PDIA3启动子结合，促进circPDIA3的表达。

图8 XBP1促进了circPDIA3的表达

CircPDIA3通过海绵化miR-449a形成一个上调XBP1的正反馈回路

研究表明，过表达circPDIA3增加了CRC细胞中XBP1的表达水平（图9A）。随后，作者使用了starBase 、miRDB、circMine和TargetScan预测出miR-34a-5p和miR-449a与circPDIA3和XBP1相互作用（图9B）。RNA pulldown结果发现miR-449a被CRC细胞中生物素标记的circPDIA3探针显著捕获（图9C）。双荧光素酶结果显示，circPDIA3可以与miR-449a相互作用（图9D-E）。此外，RIP实验进一步说明了circPDIA3与miR-449a结合的特异性（图9F），表明circPDIA3可能海绵吸附miR-449a。接下来，作者分析验证了miR-449a与XBP1的3‘非翻译区（3’UTR）之间的关系。结果表明miR-449a可以通过靶向3‘UTR区调控XBP1的表达（图9G-J）。

为了探索circPDIA3、miR- 449a和XBP1之间的相互作用关系，荧光素酶报告基因分析显示，circPDIA3过表达显著增加了WT XBP1 3‘UTR的荧光素酶活性，而共转染miR- 449a模拟物则抵消了这种效应（图9K）。qRT-PCR和Western blot检测，结果证实circPDIA3过表达显著上调了XBP1的mRNA和蛋白水平，而共转染miR-449a模拟物消除了这种效应，反之亦然（图9I-J）。QRT-PCR结果显示，XBP1在CRC组织中的表达水平与circPDIA3水平呈正相关，与miR-449a水平呈负相关。综上所述，circPDIA3可以作为ceRNA海绵化miR-449a，调控XBP1的表达，形成一个正反馈回路。

图9 CircPDIA3通过靶向miR-449a调控XBP1的表达

circPDIA3的抑制增加了体内对OXA的敏感性

为了进一步研究ASO-circPDIA3联合OXA对体内肿瘤生长的影响，作者建立了一个基于过表达circPDIA3的HCT116细胞的异种移植小鼠模型。结果表明，与单独缺乏circPDIA3相比，抑制circPDIA3联合OXA治疗后，肿瘤体积和重量减少，表明抑制circPDIA3显著使小鼠细胞对OXA治疗敏感（图10A-D）。IHC分析显示，在ASO-circPDIA3 + OXA组中发现Ki-67水平下降（图10E-F）。此外，qRT-PCR实验验证了ASO-circPDIA3在肿瘤组织中的有效抑制作用（图10G）。血清LDH分析显示，与其他各组相比，ASO-circPDIA3 + OXA组的LDH释放量减少，与体外实验结果一致（图10H）。此外，Western blot分析显示，ASO-circPDIA3 + OXA组表现出GSDME-N水平的升高，这为circPDIA3表达降低激活体内焦亡提供了证据（图10I）。综上所述，抑制circPDIA3可以显著提高CRC细胞对OXA的敏感性。

图10 CircPDIA3有助于CRC细胞体内OXA耐药

总结

总之，circPDIA3在结直肠癌中高表达，并与结直肠癌患者的OXA耐药和DFS较差呈正相关。本研究鉴定了GSDME-C结构域作为circPDIA3的靶点，并证明了circPDIA3可以抑制焦亡。在机制上，由于circPDIA3抑制了GSDME-C结构域的棕榈酰化，从而放大了GSDME-C结构域的自抑制作用，从而增强了GSDME-C结构域对GSDME-N结构域的抑制作用。此外，本研究还验证了一个circPDIA3/ miR-449a/XBP1正反馈回路的存在，可诱导化疗耐药性。综上所述，本研究探索了circPDIA3在结直肠癌中的化疗耐药作用，结果提示circPDIA3可以作为克服结直肠癌患者OXA耐药的潜在生物标志物和治疗靶点。

2024年3月9日，南方医科大学南方医院泌尿外科谭万龙教授团队研究发现在Molecular Cancer（IF=37.3）发表文章：Bladder-cancer-derived exosomal circRNA_0013936 promotes suppressive immunity by up-regulating fatty acid transporter protein 2 and down-regulating receptor-interacting protein kinase 3 in PMNMDSCs。本研究表明在PMN-MDSCs中，BCa来源的外泌体circRNA_0013936通过
circRNA_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circRNA_0013936/ miR-301b-3p/CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫。这些发现有助于为人类膀胱癌的临床治疗找到新的靶点。

PMN-MDSCs浸润性膀胱肿瘤组织中FATP2和RIPK3的表达

作者采用免疫荧光法检测肿瘤组织中PMN-MDSCs的浸润情况。双阳性细胞（CD11b+/LOX-1+）被标记为PMN-MDSCs。免疫组化显示FATP2和RIPK3的表达。图1A显示肿瘤组织中存在大量的PMN-MDSCs。肿瘤组织中FATP2的表达显著上调，而RIPK3的表达显著下调（图1B-C）。统计分析结果显示，膀胱肿瘤组织中PMN-MDSCs的浸润与FATP2的表达呈正相关，与RIPK3的表达呈负相关（图1D-E）。免疫组化结果显示，LOX-1和FATP2在人膀胱肿瘤组织中的表达高于癌旁组织，而RIPK3的表达低于癌旁组织（图1F）。此外，与I/II期患者相比，III/IV期患者在肿瘤组织中FATP2高表达，RIPK3低表达（图1G）。

图1 PMN-MDSCs浸润肿瘤微环境，过表达FATP2，低表达RIPK3

BCa衍生的外泌体上调PMN-MDSCs中的FATP2，下调RIPK3

透射电镜显示，BCa衍生的外泌体具有完整的、连续的双层膜，这是外泌体的典型形态学特征（图2A）。与PMN-MDSCs共培养后，用荧光PKH67标记的BCa衍生的外泌体被PMN-MDSCs内化（图2B）。当PMN-MDSCs与BCa来源的外泌体共培养时，PMN-MDSCs中FATP2的表达显著上调，而RIPK3的表达显著下调（图2C-D）。LC-MS分析显示，BCa衍生的外泌体促进了PMN-MDSCs中脂质代谢分子（PGE2、TG、AA）的合成（图2E）。此外，ELISA分析显示，BCa衍生的外泌体促进了PMN-MDSCs中免疫抑制分子（IL-10、iNOS、Arg-1）的合成（图2F）。

图2 BCa衍生的外泌体上调PMN-MDSCs中的FATP2，下调RIPK3

circRNA_0013936在BCa衍生的外泌体中的鉴定和表征

作者采用高通量测序来鉴定BCa衍生的外泌体中差异表达的环状RNA。其中，环状RNA表达上调比下调的环状RNA更普遍（图3A）。作者选择了10个上调最多的环状RNA。根据RNA测序和qRT-PCR结果，hsa_circ_0013936是表达差异最大的上调的circRNA（补充图2C）。图3B显示了circRNA_0013936的形成。qRT-PCR显示，与正常尿路上皮细胞来源的外泌体相比，三种BCa细胞来源的外泌体中circRNA_0013936的表达显著上调（图3C）。此外，作者还设计了聚合引物和发散引物来扩增circRNA_0013936。以UMUC3和T24细胞系的cDNA和gDNA（基因组DNA）为模板，仅在cDNA中使用发散引物扩增到circRNA_0013936，gDNA中未见扩增产物（图3D）。通过qRT-PCR，作者进一步证实了circRNA_0013936对RNase R具有耐受性（图3E）。FISH分析显示，circRNA_ 0013936主要位于膀胱肿瘤细胞的细胞质中（图3F）。

图3 circRNA_0013936的鉴定和表征

CircRNA_ 0013936在PMN-MDSCs中上调FATP2，下调RIPK3

为了证实circRNA_0013936可以在PMN-MDSCs中上调FATP2的表达，下调RIPK3的表达，作者用circRNA_0013936模拟物转染了PMN-MDSCs。Western blot结果显示，circRNA_0013936模拟物显著上调了PMNMDSCs中FATP2的表达，下调了RIPK3的表达（图4A-B）。ELISA分析显示，circRNA_0013936模拟物促进了PMN-MDSCs中免疫抑制细胞因子（Arg-1、IL-10、iNOS）的合成（图4C）。LC-MS分析显示，circRNA_0013936模拟物增加了PMN-MDSCs中脂质代谢分子（AA、TG、PGE2）的水平（图4D）。

图4 CircRNA_ 0013936在PMN-MDSCs中上调FATP2，下调RIPK3

CircRNA_ 0013936可以作为miR-320a和miR-301b-3p的海绵

为了研究circRNA_0013936是否可以在PMN-MDSCs中海绵化miRNA，作者通过CircInteractome数据库以及荧光素酶报告基因分析实验，发现了3个候选miRNA（图5A）。然后使用生物素化circRNA探针下拉PMN-MDSCs中的circRNA_0013936（图5B）。RIP实验发现circRNA_0013936、miR-320a和miR- 301b-3p特异性富集，表明miR-320a和miR- 301b-3p是PMN-MDSCs中与circRNA_0013936相关的miRNA（图5C）。图5D显示了miR-320a和miR-301b-3p在PMN-MDSCs中的基本表达情况。为了进一步证实miR-320a和miR-301b-3p是否能与circRNA_0013936结合，作者在293T细胞中进行了双荧光素酶报告实验。结果显示，miR-320a和miR-301b-3p mimic均显著降低了WT-circRNA_0013936的荧光素酶活性（图5E-G）。这些结果表明，circRNA_0013936可作为miR- 320a和miR-301b-3p的海绵发挥作用。

图5 CircRNA_ 0013936可作为miR-320a和miR-301b-3p的海绵

JAK2是miR-320a的直接靶基因，而CREB1是miR-301b-3p的直接靶基因

为了进一步探索其潜在机制，作者利用Targetscan、miRDB、DIANA-microT和Starbase预测miR-320a和miR-301b-3p的靶基因。此外，作者通过RNA测序分析了PMN-MDSCs（circ_0013936-sh vs. circ_0013936-nc）中的差异基因表达。根据RNA测序结果和对靶基因的预测，作者发现miR-320a和miR-301b-3p的下游靶基因分别有9个基因和7个基因（图6A和G）。然后，通过qRT-PCR来验证候选基因。在含有miR-320a保守结合位点的基因中，JAK2在PMN-MDSC-lv-circ_0013936中上调，在PMN-MDSC-sh-circ_0013936中下调（图6B）。在含有miR-301b-3p保守结合位点的基因中，CREB1在PMN-MDSC-lv-circ_0013936中上调，在PMN-MDSC-sh-circ_0013936中下调（图6H）。

此外，双荧光素酶报告基因检测显示，miR-320a模拟物显著降低了JAK2野生型的活性，但没有降低JAK2突变体的活性（图6C-D），miR-301b-3p模拟物显著降低了CREB1野生型的活性，但没有降低CREB1突变体的活性（图6J-K）。此外，如图6J-K和L-M所示，在转染miR-320a/miR-301b-3p模拟物或miR-320a/miR-301b-3p抑制剂的PMN-MDSCs中，JAK2和CREB1的表达在mRNA和蛋白水平上均显著上调或下调。

图6 JAK2是miR-320a的直接靶基因，而CREB1是miR-301b-3p的直接靶基因

CircRNA_0013936通过
circ_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circ_0013936/ miR-301b-3p/ CREB1通路下调RIPK3

CircRNA_0013936通过促进PMN-MDSCs中JAK2的表达来增加FATP2的表达，这一作用可被miR-320a模拟物逆转。circRNA_0013936的敲低通过降低JAK2的表达来抑制FATP2的表达，而miR-320a抑制剂可以逆转此现象（图7A-C）。CircRNA_0013936通过增加CREB1的表达来抑制PMN-MDSCs中RIPK3的表达，这一作用可被miR-301b-3p模拟物逆转。相反，敲低CircRNA_0013936会通过降低CREB1的表达促进RIPK3的表达，而miR-301b-3p抑制剂可逆转这一现象（图7H-J）。qRT-PCR和Western blot分析结果显示，敲低JAK2或CREB1可显著下调FATP2的表达或上调RIPK3的表达，并这一现象可通过过表达JAK2或CREB1来逆转（图7D-F和K-M）。CircRNA_0013936促进了PMN-MDSCs衍生的细胞因子（Arg-1、IL-10、iNOS、AA、TG、PGE2）的产生，这一作用可被miR-320a或miR-301b-3p模拟物逆转。而敲低circRNA_0013936则抑制了PMN-MDSCs衍生的细胞因子的产生，这可被miR-320a或miR-301b-3p抑制剂所逆转（图7G和N）。综上所述，circRNA_0013936通过海绵化miR-320a和miR-301b-3p来调控FATP2和RIPK3的表达。

图7 CircRNA_0013936通过miR-320a/JAK2和miR-301b-3p/CREB1通路上调FATP2和下调RIPK3

在PMN-MDSCs中，外泌体circRNA_0013936通过
circ_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circ_0013936/ miR-301b-3p/ CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫

为了研究BCa衍生的外泌体circRNA_0013936是否通过miR-320a/JAK2和miR- 301b-3p/CREB1通路调控PMN-MDSCs中FATP2和RIPK3的表达，作者使用CRISPR-Cas9基因组编辑系统生成了circRNA_0013936敲除膀胱癌细胞。然后，作者检测了与BCa-外泌体或circRNA_0013936-KO-Bca-外泌体共培养的PMN-MDSCs中FATP2和RIPK3的表达。图8A-B，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936海绵化miR-320a，通过激活JAK2/pSTAT5通路促进FATP2的表达，而circRNA_0013936-KO-外泌体则表现出相反的作用。同时，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936海绵化miR-301b-3p，然后通过激活CREB1通路抑制RIPK3的表达，而circRNA_0013936-KO-外泌体则表现出相反的作用（图8D-E）。最终，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936促进了PMN-MDSCs的免疫抑制细胞因子的产生（图8C，F）。

为了研究BCa来源的外泌体circRNA_0013936是否通过调节PMN-MDSCs中的FATP2和RIPK3来影响CD8+ T细胞的功能，作者将CD8+ T细胞与BCa来源的外泌体或circRNA_0013936-KO-BCa-外泌体诱导的PMN-MDSCs共培养。流式细胞术和CFSE分析结果显示，BCa来源的外泌体通过调节FATP2和RIPK3的表达，显著抑制了IFN-γ的产生和CD8+ T细胞的增殖功能，而circRNA_0013936-KO-BCa-外泌体则表现出相反的作用（图8G-H）

图8 在PMN-MDSCs中，外泌体circRNA_0013936通过miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过miR-301b-3p/CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫

小结

在BCa衍生的外泌体中富集的CircRNA_0013936可以促进FATP2的表达，并抑制PMN-MDSCs中RIPK3的表达。在机制上，circRNA_0013936通过海绵化miR-320a和miR-301b促进RIPK2的表达，而miR-301b分别直接靶向JAK2和CREB1，抑制RIPK3的表达。最终，circRNA_0013936在PMN-MDSCs中，通过
circRNA_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circRNA_0013936/miR-301b/CREB1通路下调RIPK3，显著抑制CD8+ T细胞的功能。结果表明，circRNA_0013936有望成为BCa的有效治疗靶点。这些发现为膀胱癌的临床治疗提供了理论基础和新的思路。

近期，广东省人民医院胃肠外科主治医师李勇在Advanced Science上发表文章：A Novel Protein Encoded by Exosomal CircATG4B Induces Oxaliplatin Resistance in Colorectal Cancer by Promoting Autophagy。文章表示：L-OHP虽常用于结直肠癌手术切除后的化疗方案，但是其耐药性的出现会影响CRC患者的疗效。而circATG4B是L-OHP耐药发生的关键。机制在于，circATG4B可编码一种新的蛋白质（circATG4B-222aa）与TMED10互作，阻止TMED10与ATG4B结合，从而导致自噬增加，继而诱导L-OHP耐药。研究揭示了外泌体circATG4B参与了CRC细胞化疗敏感性的降低，为潜在的治疗CRCL-OHP 耐药靶点提供了新的理论基础。

1.L-OHP耐药CRC中ATG4B相关circRNA的分析

图6.circATG4B-222aa与TMED10蛋白互作，释放ATG4B

图7.circATG4B-222aa拮抗TMED10作用，诱导细胞L-OHP耐药

2022年8月29日，浙江大学医学院附属第一医院骨科王勇医师在Experimental and Molecular Medicine发表文章Circular RNA ROCK1, a novel circRNA, suppresses osteosarcoma proliferation and migration via altering the miR-532-5p/PTEN axis。结果显示：OS中circROCK1-E3/E4的表达受到QKI（RNA结合蛋白）调节，并起到抑制肿瘤生长的作用。机制上，过表达circROCK1-E3/E4可发挥miR-532-5p海绵作用上调PTEN（一种抑癌基因）来抑制OS细胞增殖和迁移。并且裸鼠模型中，过表达circROCK1-E3/E4抑制肿瘤生长和肺转移。本研究证明了circROCK1-E3/E4在OS进展中的功能和分子机制，诸多发现可作为OS分子治疗的新靶点。

图1.circROCK1-E3/E4的特性

图2. circROCK1-E3/E4表达受到QKI的调控

图4. circROCK1-E3/E4海绵机制

图5. miR-532-5p靶向PTEN调控OS细胞增殖和迁移

 

作者证实circROCK1-E3/E4在蛋白水平上正向调控PTEN的表达，而miR-532-5p加入则可逆转这一作用。在细胞功能上，miR-532-5p也能够逆转circROCK1-E3/E4对细胞增殖/迁移/侵袭的作用。综上所述，circROCK1-E3/E4至少部分通过调控miR-532-5p/PTEN轴促进细胞增殖和迁移/侵袭。

 

图6.circROCK1-E3/E4通过调控miR-532-5p/PTEN轴介导OS细胞增殖和迁移

图7.circROCK1-E3/E4在体内抑制OS生成circROCK1-E3/E4在

总结

作者首次在研究中发现，circROCK1/E3E4受QKI调控，可靶向OS中的miR-532-5p/PTEN轴来调控OS细胞增殖和迁移。本研究结果可为进一步探索OS中circRNA的功能、诊断和治疗方案奠定基础。

circROCK1/E3E4在OS中潜在的分子机制

免疫代谢类疾病已成为重大的公共健康问题，与高能量摄入和久坐有关，常带有炎症特征，包括非酒精性脂质性肝炎（NASH），糖尿病，肥胖等等。代谢紊乱如何导致不可控制的炎症状态的机制目前还没有很好的解决。在脂质暴露的肝脏成纤维细胞中，作者发现了线粒体来源的ROS与促炎症表型有关。结合芯片分析的circRNA表达谱，发现了三个线粒体来源的在NASH中显著下调的circRNA分子。作者利用开发的靶向线粒体的mito-NP递送系统，过表达三个circRNA看对ROS生成和胞质/线粒体ROS量的影响情况，最终确定hsa_circ_0089762与NASH中线粒体ROS释放有关，基于后期的研究结果，作者将该circRNA命名为SCAR。SCAR直接与ATP5B相互作用，阻止ATP5B与CypD的结合并抑制mPTP的开放，进而抑制线粒体ROS的释放。利用线粒体靶向递送系统表达SCAR能抑制NASH的促炎症表型。动物模型和临床标本实验进一步验证了这些现象和机制（[1]）。下面我们就一起学习一下本文的主要内容：

 1、线粒体ROS介导脂质暴露后成纤维细胞的促炎症表型

作者分离NASH和对照患者肝脏成纤维细胞，SeaHorse检测代谢指标OCR和ECAR，结果显示NASH患者肝脏成纤维细胞OCR和ECAR均升高，并且ECAR/OCR的比值在NASH患者中也升高。Palmitate处理正常成纤维细胞也有相似的变化情况。这说明脂质暴露可诱导成纤维细胞ATP生成方式从线粒体TCA循环和氧化磷酸化为主转变为胞质糖酵解为主。JC-1检测线粒体跨膜电势结果显示，NASH肝脏成纤维细胞中跨膜电势显著降低。透射电镜结果表明NASH肝脏成纤维细胞线粒体呈现肿胀状态（Swell）。线粒体在应激状态往往会表现出ROS增高的情况，为检测出ROS在胞质（cROS）和线粒体（mROS）中的含量，作者选择了两种检测的技术方法：一种是荧光探针法，mitoSOX可特异性显示线粒体中ROS的含量，DCFH-DA可特异性检测胞质中ROS的含量；另一种是转染不同定位的ORP蛋白，ORP蛋白是一种ROS敏感的蛋白，可以通过测定405/488 nm 荧光比值测定ROS含量，分别将特殊定位信号融合可介导胞质（cytoORP）和线粒体（mitoORP）定位。两种方法均显示，NASH肝脏成纤维细胞cROS和mROS均升高。Palmitate处理正常成纤维细胞也有相同的变化。已知线粒体中ROS可以通过mPTP通道渗透至胞质中，这可能也是胞质ROS的主要来源。mPTP抑制剂cyclosporine A处理后在NASH肝脏成纤维细胞和Palmitate处理正常成纤维细胞中cROS均降低，说明上面检测到的ROS升高主要是线粒体来源的mROS生成增高所致，mPTP孔的开放促进了cROS的增高。ROS介导了很多的免疫细胞活化，但在成纤维细胞活化过程中的作用还没有相关的研究。ROS抑制剂（mitoTEMPO和DPI）可抑制NASH肝脏成纤维细胞收缩性，抑制I型和III型胶原及α-SMA的表达，一些炎症相关因子表达也显著下降，包括IL-1β，IL-8，TNF-α，CCL-2。这些数据说明mROS介导了成纤维细胞脂质暴露后的一些促炎症表型。

图1  mROS与NASH肝脏成纤维细胞促炎症表型 （[1]）

 2、脂质暴露改变线粒体circRNA表达谱

成纤维细胞中circRNA的认识还非常有限，为了进一步探索上面发现的这些现象，作者收集了NASH和健康对照的肝脏成纤维细胞各4例，进行circRNA的芯片检测。NASH组显著下调的circRNA分子中线粒体DNA来源的circRNA比较靠前，一共分析到了4个线粒体DNA表达的circRNA，其中有三个是表达下调显著的。分离胞质和线粒体组分的实验也验证了这三个circRNA的定位，均为线粒体定位。

图2  NASH肝脏成纤维细胞线粒体circRNA表达下调 （[1]）

 3、hsa_circ_0089762（SCAR）显著降低NASH肝脏成纤维细胞cROS

细胞中线粒体靶向递送是非常有挑战的技术难题，作者设计了一种特殊的pH敏感的线粒体靶向递送纳米颗粒（mito-PN），该系统可以实现特异性的将circRNA过表达载体输送至线粒体中。mito-PN颗粒被细胞内吞后进入内含体，其中的酸性环境导致mito-PN外层的包裹物质子化和解离，释放内层的线粒体靶向多肽TACP，最终实现将所包裹的质粒输送至线粒体中。为验证mito-PN靶向线粒体递送的效率，作者用lipo-3000作为对照，比较输送GFP表达载体在线粒体中靶向递送的效率。3D成像的数据显示，lipo-3000仅有12%左右的GFP信号与线粒体是共定位的，而mito-PN的线粒体定位效率可达90%。利用这一递送体系，作者发现过表达hsa_circ_0089762可显著降低NASH肝脏成纤维细胞cROS的升高，另外两个circRNA的一个不能通过mito-PN表达和递送（分子太大），另一个没有明显的效应。后面作者就将hsa_circ_0089762作为研究的目标分子，并根据其作用机制将其命名为SCAR（steatohepatitis-associated circRNA ATP5B regulator）。

图3  SCAR抑制NASH肝脏成纤维细胞cROS（[1]）

 4、SCAR定位于线粒体，抑制成纤维细胞活化

FISH检测表明90%的SCAR信号均定位于线粒体，反向引物，RNase R分析，Northern检测鉴定了SCAR的circRNA特性。利用mito-PN系统在NASH肝脏成纤维细胞中过表达SCAR后线粒体膜电势恢复，Palmitate处理正常成纤维细胞也有同样的变化结果。Palmitate处理正常成纤维细胞中过表达SCAR后cROS和mROS均下降。NASH肝脏成纤维细胞中过表达SCAR可有效抑制细胞收缩性，I型和III型胶原及α-SMA的表达，抑制促炎症相关因子的表达，这些表型与ROS抑制的效应相似。

图4  SCAR定位于线粒体，抑制成纤维细胞的活化（[1]）

 5、SCAR与ATP5B相互作用

为进一步分析SCAR的作用机制，作者分别分析了SCAR的ORF和miRNA的结合情况。预测的ORF中在终止密码子前添加3× Flag标签，如果该ORF可被翻译，可以通过WB检测相应的条带，作者在该体系中没有检测到相关的条带，因此没有进行翻译产物的分析。同样的，作者也预测了可能的miRNA结合位点，但没有一种miRNA的结合位点超过两个，并且这些miRNA都不是线粒体表达的，因此作者也没有从miRNA Sponge的角度进行分析。最终，作者通过RNA pull-down捕获了与SCAR的相互作用蛋白，质谱鉴定后发现了ATP5A和ATP5B均可以被捕获。细胞内ATP5A和ATP5B是直接相互作用的，SCAR是否同时与两者相互作用，还是仅与其中一个相互作用？体外纯化两种蛋白后EMSA分析实验表明，SCAR主要与ATP5B相互作用。不同线粒体定位的APEX标记体系显示，SCAR与ATP5B主要在线粒体基质中相互作用。序列分析表明，SCAR的100-182有颈环结构，删除突变实验表明SCAR主要通过这一段与ATP5B相互作用。之前的一项蛋白质谱研究数据显示ATP5B中的一段肽序列可能是与SCAR相互作用的位置，突变实验证明了这一段肽段与SCAR的相互作用有关。

图5 SCAR与ATP5B相互作用（[1]）

 6、SCAR结合ATP5B阻断与CypD的相互作用，抑制成纤维细胞活化

mPTP通道的开放与线粒体膜电势降低和ROS升高有关，ATP5B是一种mPTP通道的调节蛋白，因此作者进一步探索了SCAR与mPTP通道的关系。Calcein释放分析可检测mPTP通道的开放，分析显示Palmitate处理正常成纤维细胞可显著释放calcein，而过表达SCAR后该效应消失，单过表达ATP5B结合位点的SCAR没有这种效应。CypD可以通过结合APT5亚基调控mPTP通道的开放，是否SCAR是通过影响CypD与ATP5B的相互作用而影响了这一过程？分别过表达SCAR野生型和突变型后Palmitate处理，CoIP分析CypD与ATP5B的相互作用情况，结果显示，过表达野生型SCAR能显著抑制两者的相互作用，而过表达突变型的SCAR没有这种效应。JC-1检测跨膜电势，cROS检测及细胞收缩性，I型和III型胶原及α-SMA的表达，抑制促炎症相关因子的表达检测结果表明，SCAR与ATP5B的相互作用阻止了CypD与ATP5B的相互作用，进而抑制了mPTP的开放，并进一步抑制了成纤维细胞活化的作用。

图6  SCAR结合并抑制CypD与ATP5B相互作用，抑制成纤维细胞活化 （[1]）

 7、脂质暴露诱发ER Stress，通过CHOP抑制PGC1α和SCAR表达

SCAR由线粒体的轻链表达，它的来源基因是JA760600，已知一些核基因组编码的剪切相关的因子能进入线粒体并介导RNA的剪切，包括eIFA3，7种hnRNP蛋白。siRNA分析表明hnRNPM介导了SCAR的生成，其他蛋白的siRNA没有明显的效应。CLIP实验数据也证明了hnRNPM在SCAR侧翼的结合位点。RNase L可介导circRNA的降解，干扰RNase L后能显著抑制SCAR的降解。脂质暴露可导致成纤维细胞中SCAR的表达，为分析介导这一过程的因子，作者首先分析了SCAR和来源基因JA760600的转录因子位点，发现在上游-25~-18的位置有PGC1α的结合位点，ChIP实验验证了结合位点，Palmitate处理后PGC1α结合下降，干扰PGC1α也可抑制SCAR的表达。脂质暴露可诱导ER stress，进而诱导CHOP抑制PGC1α的表达。作者在 NASH肝脏成纤维细胞中检测了这些标志基因，Palmitate处理后干扰CHOP可恢复PGC1α的表达，并进而恢复SCAR的表达水平。这些数据表明，SCAR受到PGC1α的调控，脂质暴露后诱发ER stress，进而诱导CHOP上调，抑制PGC1α，进而导致SCAR的表达下调。

图7 脂质暴露诱发ER Stress，通过CHOP抑制PGC1α和SCAR表达（[1]）

 8、SCAR缓解高脂饮食诱导小鼠肝硬化

小鼠中没有SCAR的同源产物，但小鼠的Atp5b与人的ATP5B高度同源，预实验表明SCAR可以与小鼠Atp5b相互作用。预实验也表明mito-PN可以在小鼠肝脏中实现有效的线粒体递送。因此可以借助该递送系统探索小鼠中过表达SCAR的效果。结果显示，过表达SCAR能够显著缓解高脂饮食诱导的肝硬化表型。

图8 小鼠中过表达SCAR抑制高脂饮食诱导的肝硬化（[1]）

 9、临床标本中SCAR与肝脏脂肪变性到NASH的转变过程相关

为分析SCAR在临床标本中的表达与临床表型的关系，作者利用FISH检测分析了SCAR在NAFLD标本中的表达情况，结果显示，SCAR的表达状态与肝硬化评分和DHE阳性肝成纤维细胞比例显著负相关，健康肝组织，轻度肝脏脂肪变性，NASH轻度纤维化和NASH肝硬化的标本中SCAR的表达依次递减。这些数据表明SCAR的表达状态与NASH病变过程高度相关。

图9 临床标本SCAR表达与NASH疾病进程显著负相关（[1]）

本文从发现SCAR在NASH中表达下调，依次分析了SCAR的作用机制，生成机制，直到小鼠模型和临床标本验证，系统揭示了SCAR在NASH中的表达状态和功能机制。SCAR是线粒体来源的circRNA，作者开发的mito-PN体系有效的解决了线粒体中特异性递送和表达外源circRNA的技术问题，为线粒体来源circRNA的功能研究提供了借鉴，也再次证明circRNA是一类功能强大的分子，未来依然有很多值得探索的科学和临床问题。

参考文献

1. Zhao et al., Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output, Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009

2020年5月4日，中科院上海生化细胞所的陈玲玲教授在Nature Reviews Molecular Cell Biology杂志（IF=43.351）上发表了一篇题为“The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs”的综述，详细汇总介绍了环状RNA的生成机制、调控机制、功能机制和在细胞中发挥的作用（[1]）。

高等真核生物中的许多蛋白质编码基因都可以通过外显子的反向剪接产生环状RNA（circRNA）。circRNA的生成、结构和降解机制都不同于mRNA，因此circRNA具有独特的细胞功能。在这篇综述中，作者系统汇总了circRNA的生成、调控及其生物学功能的最新进展，包括在基因转录与剪接，作为大分子阻遏物或脚手架参与干扰microRNA及信号通路的活性，作为模板翻译蛋白等。此外，作者还进一步讨论了circRNA在调节免疫应答和细胞增殖中的新型作用机制，以及circRNA技术在生物医学中的潜在应用。

1 环状RNA的生成

1.1 反向剪接与转录过程相偶联

circRNA是由pre-mRNA的反向剪接产生的，内含子下游5’剪接位点是以相反的顺序与上游3’剪接位点连接，形成环状RNA，并在反向剪接的外显子之间形成3’，5′-磷酸二酯键。此外，在mRNA剪接过程中切除的内含子套索有时可以逃避降解，并在剪接供体和分支点之间形成具有2’，5′-磷酸二酯键的环状RNA，这些RNA环被称为环状内含子RNA。circRNA与成熟的mRNA均由同一个基因转录产生，circRNA可以视为一种特殊的RNA可变剪切产物，绝大部分的circRNA与mRNA使用相同的拼接位点和剪切机制。大多数人类的circRNA包含多个外显子，通常为两个或三个。在人类细胞中，单外显子形成的circRNA长度中位数在353nt，多外显子的circRNA每个外显子的长度中位数在112-130nt。circRNA剪切形成过程需要聚合酶II（Pol II）和常规的剪切体协同完成。

一项早期的研究表明，从果蝇头部分离的染色质RNA中存在大量的新生circRNA，这表明反向剪接和Pol II转录之间存在偶联。通过分析人类细胞中Pol II转录延伸速率（TER）发现，能形成circRNA的基因平均TER要高于不能生成circRNA的基因，改变TER可以显著影响circRNA的生成效率。一个可能的机理是TER高的基因允许更多含有内含子互补序列（ICS）的内含子转录，增加了跨外显子ICS配对的可能性，从而增加了反向剪接的可能性。还可能的原因是，与较高TER关联的线性剪接减少从而增加反向剪接。果蝇中表达慢速型Pol II也可以抑制circRNA的生成，并且可以在聚腺苷酸化和切割前伴随生成一些转录通读型的反向剪切产物。circRNA的反向剪接也可以发生在转录后。研究表明，数千个新生circRNA是在pre-mRNA转录完成后才能检测到。过表达报告载体实验表明，circRNA生成也与mRNA 的3’末端加工过程有关，抑制3’末端的加工可诱导Pol II的转录通读产物生成比例的增加，也可导致circRNA形成增加。

1.2 反向剪接与线性RNA的剪接过程相偶联

反向剪接通常发生在基因的中间外显子中，从理论上讲应该会影响线性RNA的剪接。在大多数内源性基因座中，反向剪接的效率远低于线性RNA的剪接的效率（不到1％）。有人提出使用5’和3’剪接位点进行的反向剪接可以与线性RNA的剪接竞争，从而增加了缺少环化外显子的线性RNA的比例。虽然不是所有的剪切过程中跳过的外显子都可以成环，但已经发现一些基因中，成环越多的外显子，最后进入mRNA的比例就越低，例如大鼠细胞色素P450 2C24基因。

目前有两个模型来解释在同一基因座上反向剪接和剪接是如何偶联的。在“直接反向剪接”模型中，首先在中间的外显子发生反向剪接来产生circRNA，下一步剪接产生不带有中间跳过的外显子的线性mRNA。在“套索过渡体”模型中，首先剪接跳过中间的外显子产生线性mRNA，这段剪切下来的片段再发生反向剪切，形成circRNA。虽然在某些基因中已经观察到了外显子跳跃和circRNA产生之间的相关性，但这些机制能否产生circRNA以及哪些特征决定了circRNA是如何产生的仍然是一个谜。不管确切的机制如何，由于下游5‘剪接位点与上游3’剪接位点在空间上不利连接，细胞中的反向剪接的效率一般都很低。

1.3 环状RNA的选择性剪接

一个基因座可以通过可变的反向剪接（改变剪接位点的选择）产生多个circRNA。理论上存在两个模式的可变剪接，每个都是使用不同的下游5‘剪接供体或上游3’剪接受体，从而使单个基因座产生不同的circRNA。在含多个外显子circRNA选择性剪切中，存在四种类型，分别是外显子保留、内含子保留、5‘选择性剪接和3’选择性剪接。在人类细胞的中，超过50%的表达位点可以通过选择性反向剪接产生多个circRNA。

与线性RNA剪接相比，circRNA的选择性剪接至少有三个独特的方面。首先，circRNA的产生可以通过某种方式绕过其同源mRNA产生过程中使用的剪接位点。例如，在CAMSAP1基因中可以产生包括或不包括内含子的两种circRNA异构体。其次，通过选择性反向剪接，circRNA中包含了数千个以前未注释的外显子，这些外显子在mRNA中往往是检测不到的。第三，circRNA特异性的外显子似乎是高度动态调节的。例如，人类胚胎干细胞向神经系分化的过程中，一些外显子在环状RNA(如XPO1基因产生的环状RNA)中的含量显著增加，但在线性RNA中并没有。circRNA的选择性反向剪接是如何实现的，以及选择性剪接的circRNA是否保留功能，仍需要进一步研究。

图1 反向剪接介导circRNA的产生

2 环状RNA丰度的调控

2.1 内含子互补元件促进反向剪接

虽然外显子的反向剪接发生在细胞核内，但绝大多数无内含子的circRNA定位于细胞质。因此，circRNA的稳态丰度是由circRNA生成、核输出和降解等因素共同决定的。

侧翼内含子互补序列（ICS）促进circRNA的生成。一项早期的研究发现，小鼠circSry(一种由Sry基因产生的circRNA)两侧有许多ICS，而将ICS插入到载体中就足以产生circSry。在人类细胞中，这种RNA互补通常由反向Alu元件介导，人们也发现RNA的配对能促进无脊椎动物(例如线虫和果蝇)中circRNA的形成。在血小板来源的circRNA的表达载体中，ICS的序列为30-40个核苷酸，甚至23个核苷酸都能诱导表达载体产生circRNA。不同内含子上ICS之间的配对被认为使远端剪接位点更接近，从而增强了反向剪接。表达载体的突变实验表明，消除RNA配对显著降低了circRNA的产量。通过CRISPR–Cas9介导的ICS基因移除，会导致人类细胞的circGCN1L1和鼠细胞的cia-cGAS完全缺失。

一般来说，ICS可以促进circRNA的形成，但它们的存在既不是充分的，也不是必要的。首先，同一内含子中RNA的配对与侧翼内含子之间RNA的配对竞争，从而使线性RNA的剪接变得容易，并减少circRNA的产量。其次，同一基因的不同内含子之间可能形成多个RNA配对，这种竞争可能导致选择性的反向剪接和不同的circRNA的形成。第三，重复元件在哺乳动物基因组中很丰富，但在其它生物中，ICS对circRNA的形成似乎不那么重要。

2.2 反式作用因子调控反向剪接

剪接和可变剪接都受剪接体功能相关的蛋白和与侧翼内含子顺式元件结合的RNA结合蛋白(RBP)的调控。除了ICS调节反向剪接的作用外，许多RBP还控制circRNA的产生。使用表达载体实验显示，剪切因子的缺失会导致剪接向反向剪接转变，如蛋白U1、剪接因子3B复合物和SLU7。用剪接抑制剂isoginkgetin处理大鼠神经元后，发现circRNA的水平也有类似的增加。因此有人提出，当剪接体核心因子减少时，跨内含子的外显子决定复合体（exon definition complexes）效率会降低，导致线性mRNA的产量减少，并促进跨单外显子的外显子决定复合体更有效的的组装。

除了核心剪接体因子外，RBP通常还具有两种模式调节反向剪接：一是通过衔接反向剪切位点促进成环；二是结合ICS位点调控反向剪接。第一种情况包括几种RBP调节的单个基因或多个基因的反向剪接。如在黑腹果蝇中，RBP Muscleblind （Mbl）通过与侧翼内含子中的Mbl结合位点结合，促进了circRNA circMbl的产生。与单个基因的观察不同，QKI与人类细胞上皮-间质转化过程中数百个circRNA的上调有关。QKI是通过与侧翼的内含子结合来增强circRNA的形成，QKI二聚体的形成可以使剪接位点更靠近，以利于反向剪接。异种核糖核蛋白L（HNRNPL）通过直接结合人前列腺癌细胞的侧翼内含子来增强数十种circRNA的形成。在小鼠ES细胞来源的运动神经元中，FUS与侧翼的内含子相互作用，并影响大量circRNA的表达，而对同源线性mRNA的影响不大。

第二种情况，RBP通常包含双链RNA（dsRNA）结合域（dsRBD），dsRBD与ICS结合并稳定侧翼内含子RNA配对。ILF3基因编码的蛋白核因子90（NF90）和NF110包含两个dsRBD，并通过直接结合内含子反向重复Alu元件来促进circRNA的形成。此外，NF90或NF110的缺失导致HeLa细胞中新生circRNA的水平全面降低，将野生型NF90重新引入到NF90缺失的细胞中，可以挽救circRNA表达。尽管NF90和NF110在促进反向剪接方面具有作用，但dsRNA结合蛋白还可以通过破坏RNA配对的稳定性来抑制circRNA的形成。DHX9结合内含子上反向重复Alu元件，并利用其RNA解旋酶活性解开侧翼内含子RNA配对，因此，DHX9的缺失增加了circRNA的水平。RNA 1的腺苷脱氨酶（ADAR1，也称为dsRNA特异性腺苷脱氨酶）通过对反向重复Alu元件的自动编辑来抑制反向剪接。由于这些RBP均与反向重复Alu元件结合，因此尚不清楚它们是否以及如何竞争或协同作用来平衡circRNA的产生。多个RBP很可能通过协同作用以调节反剪接。

图2 circRNA反向剪接的调控

2.3 circRNA的核输出

与许多线性mRNA类似，含有内含子的circRNA经常被隔离在细胞核中，大多数的circRNA主要位于细胞质中。如何调控circRNA的核输出或保留的机制研究仍不清楚，最近的一项研究使用RNA干扰技术（RNAi）筛选来确定控制circRNA核输出的关键因素。这项研究表明，黑腹果蝇中ATP依赖性的RNA解旋酶Hel25E（也称为WM6）的缺失导致了长（超过800个核苷酸）circRNA在细胞核中的特异性积累。同样，DDX39B或DDX39A（Hel25E的两个人类同源物）的缺失分别导致长（大于1300个核苷酸）或短（小于400个核苷酸）circRNA在细胞核中的积累。这些结果表明，circRNA根据其长度以某种方式参与其输出。此外，人类细胞中的大多数circRNA都短于500个核苷酸并趋于形成RNA双链体，而长circRNA可能采用不同的构象。短circRNA和长circRNA之间的构象差异可能解释了Hel25E的差异募集。最后，N6-甲基腺苷（m6A）修饰广泛发生在circRNA上，考虑到m6A对mRNA不同方面的影响，包括m6A结合蛋白YTHDC1对甲基化mRNA核输出的影响，有待确定m6A是否影响circRNA的输出。

2.4 circRNA的降解

circRNA由于其环状结构，这使它们能够抵抗RNA外切酶的降解。circRNA比其同源线性转录本更稳定，circRNA半衰期的中位数为18.8至23.7小时，而同源线性RNA半衰期的中位数仅为4.0–7.4小时。不管circRNA的先天稳定性如何，最近的研究表明它们在正常条件下和应激条件下都会发生降解。一方面，miRNA与circRNA结合可以启动circRNA降解。例如，circRNA CDR1as含有miR-671结合位点，它们的结合会介导AGO2对 CDR1as的降解。但是，这种降解似乎是CDR1as特有的，绝大部分circRNA结合miRNA的位点仅由几个碱基构成，这不足以激发AGO2介导的靶向降解circRNA作用。

其它的核酸内切酶也参与circRNA的降解。胞质核酸内切酶RNase L在病毒感染过程中病原dsRNA的存在下被激活，之后广泛降解circRNA。核糖核酸酶复合物RNase P / MRP可降解m6A修饰的circRNA。该降解由m6A识别蛋白YTHDF2和HRSP12调控，HRSP12可以连接YTHDF2和RNase P / MRP来介导RNA的降解。此外，高度结构化的circRNA可以被UPF1及其相关的核酸内切酶G3BP1所降解。然而，负责维持正常和未受压细胞中circRNA稳态的其它途径仍尚待鉴定。

图3 circRNA核输出和降解的调控

3 环状RNA的功能机制

3.1 环状RNA调节转录、剪接和染色质相互作用

细胞核中的circRNA参与转录的调控、选择性剪接和染色质环化（looping）。在拟南芥中，circSEP3调节SEPALLATA3（也称为SEP3）的剪接，SEPALLATA3是花卉同源表型所需同源MADS-box的转录因子。circSEP3源自SEP3的第6外显子，并与其同源DNA形成RNA-DNA双链，导致转录暂停，随后跳过第6外显子，并形成选择性剪接的SEP3 mRNA。在玉米中，着丝粒逆转录转座子转录的RNA中发现了反向剪接，生成的circRNA与着丝粒结合通过形成R环来促进染色质环化。下一步需要探索circRNA如何保留在细胞核中以及它们如何精确地参与基因调控。

3.2 环状RNA可以充当microRNA诱饵

一旦进入细胞质，一些circRNA就会起竞争性内源性RNA（ceRNA）的作用，它们作为miRNA海绵与miRNA结合并阻止其对靶mRNA的抑制作用。尽管担心细胞中实现ceRNA作用所需的circRNA和miRNA结合位点的数量，但已显示出几种丰富的circRNA可以充当miRNA海绵。小鼠circSry包含16个miR-138的靶位点，并与睾丸发育有关。在人类细胞中，circHIPK2是miR124-2HG的海绵，并可以在自噬和内质网应激期间调节星形胶质细胞的活化，而circHIPK3的高表达则通过海绵化多个不同的miRNA来促进细胞增殖或调节胰岛素分泌。此外，circMAT2B97和circASAP1可以通过在缺氧条件下激活circMAT2B–miR-338-3p–PKM2轴或circASAP1–miR-326–miR-532-5p–MAPK1–CSF1信号通路来促进肝癌的发展。

在已报道的所有circRNA中，最引人注目的是CDR1as（也称为ciRS-7），它含有70多个miR-7保守的结合位点，并在哺乳动物脑中大量表达。人类细胞系中CDR1as的表达降低导致携带miR-7结合位点的mRNA表达降低，这表明CDR1可以作为miR-7的海绵并发挥ceRNA作用。在小鼠中，Cdr1as的缺失会导致miR-7的表达降低和其相关的靶mRNA的变化，并表现出兴奋性突触传递功能障碍的神经精神疾病，表示Cdr1as可能会具有稳定miR-7的作用，但是机制尚不清楚。

Cdr1as–miR-7轴还受长链非编码RNA Cyrano（也称为Oip5os1）的调控，Cyrano可以结合miR-7并因此促进miRNA降解，是从miR-7的3’末端的拖尾和修剪开始。这种降解反过来使Cdr1as在小鼠大脑中积累。在Cyrano缺失的小鼠中，miR-7水平的升高会导致神经元中Cdr1as的降解。在小脑中，另一种miRNA miR-671也会促进Cdr1as的下调。尚不清楚miR-671和miR-7在介导Cdr1as抑制中是如何协同的。由于哺乳动物中的circRNA通常以低水平表达，并且与miRNA的结合位点相对较少，因此应仔细考虑低表达的circRNA是如何控制miRNA的稳定性和数量的。

3.3 环状RNA充当蛋白支架

circRNA在其生命周期中经常与不同的蛋白质结合。例如，含有外显子和内含子的circRNA（EIciRNA）可以通过与小核糖核蛋白U1和Pol II相互作用来促进其亲本基因的转录。circFoxo3在小鼠非癌细胞中高度表达，并与细胞周期相关。它与细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（p21）相互作用，形成circFoxo3-p21-CDK2三元复合物并抑制CDK2功能，这通常是细胞周期所必需的。circACC1通过与AMPK β和γ调节亚基形成三元复合物，促进AMP激活蛋白激酶（AMPK）全酶的酶促活性，使细胞适应无血清培养。circAMOTL1，在新生儿心脏组织中高度表达。它同时与激酶AKT1和磷酸肌醇依赖性激酶1（PDK1）结合，通过PDK1导致AKT1磷酸化，从而促进有心脏保护功能的AKT1的核定位。

3.4 环状RNA可以竞争性结合蛋白

circRNA可以结合蛋白质，其中多个circRNA可以充当蛋白质的海绵。例如，circMbl通过结合MBL蛋白并阻止其执行其它神经功能。circANRIL与动脉粥样硬化性心血管疾病有关，它通过与核糖体60S亚基装配必需因子结合，抑制血管平滑肌细胞和巨噬细胞中核糖体的产生，从而导致与动脉粥样硬化相关的核仁应激和细胞死亡。circPABPN1大多数定位于细胞质，并抑制RBP HuR（也称为ELAVL1）与其线性同源PABPN1 mRNA的结合，从而导致mRNA翻译减少。

3.5 环状RNA的宏观生物学功能

与上文提及细胞中是否存在足够数量的ceRNA和miRNA结合位点的担忧类似，通常低表达的circRNA是如何对高表达的蛋白进行调控，需要精密检测circRNA及其相关蛋白之间的化学计量关系。例如，HuR会影响RNA的输出，稳定性和翻译，它是一种非常丰富的蛋白质。尽管circPABPN1可以有效抑制HuR与PABPN1 mRNA的结合，但尚不清楚低含量的circPABPN1是如何发挥这种作用，即使考虑到circPABPN1包含多个HuR结合位点也是如此，因为相同的结合位点也存在于同源线性mRNA中，并比环状RNA丰富得多。因此，仍然需要阐明circPABPN1与HuR特异性结合的分子机制。据推测，circRNA（而非其同源mRNA）采用独特的构型和/或经过独特的修饰以实现与HuR的强特异性结合，或者在特定生物亚细胞微环境中发挥作用。除了从特定circRNA分析其功能，胞内总circRNA作为一个整体，也有其生物学功能。胞内总circRNA可以通过结合双链RNA结合蛋白NF90，NF110 及PKR等发挥功能。早期研究中还发现，ALS疾病中累积的套索内含子环状RNA可阻遏TDP43的毒性作用。人类中DBR1双等位基因突变可促进套索内含子环状RNA，导致对脑干严重病毒感染的易感性增高。这些例证均暗示胞内总circRNA也可以发挥特定的功能，不依赖于其序列。

值得注意的是，circRNA的这些作用方式（支架或竞争性结合蛋白）并不是相互排斥的，需要其它研究来确定在不同情况下circRNA和蛋白质相互作用的分子基础。

图4 circRNA的功能机制

4 环状RNA在细胞和生理状况下作用

4.1 环状RNA在免疫系统中的作用

使用双色报告系统同时检测剪接和反向剪接的反式作用因子，它们可能会影响circRNA的产生，来寻找内源性circRNA与先天免疫应答之间的联系。该方法已鉴定出100多种可以特异性调节反向剪接的蛋白质，其中包括30多种剪接调节剂，例如FUS和HNRNPL，以及16种在免疫应答中有作用的因子。在这些免疫因子中，存在先天免疫相关的NF90和NF110，如前所述，NF90和NF110通过稳定侧翼内含子反向重复Alu元件配对来促进反向剪接。用模拟病原dsRNA的poly（I：C）处理细胞后，例如水泡性口炎病毒（VSV），NF90和NF110迅速输出到细胞质中，与病毒mRNA结合并介导翻译抑制，同时，它们在细胞核中的缺失导致了circRNA的产生减少。circPOLR2A或circmCherry的异位表达，减轻了NF90或NF110与VSV mRNA的结合，从而导致VSV复制增强。这项研究表明，在感染病毒后，宿主细胞必须以某种方式限制circRNA的产生，而增加的circRNA水平可以促进病毒繁殖。

不仅在病毒感染期间circRNA的产生受到限制，细胞中80-90％的circRNA会被激活的RNase L迅速降解。RNase L可以快速降解circRNA，至少部分原因是由于NF90和NF110的核输出导致细胞中反向剪接效率低下所致。因此，新产生的circRNA数量不足以替代迅速降解的数量。在病毒感染后，RNase L快速且全面降解circRNA，导致释放PKR、NF90和NF110产生抗病毒活性。

circRNA自身在免疫反应中也有作用。 例如，cia-cGAScan可保护静态造血干细胞免受先天性免疫反应介导的疲劳。在小鼠肠干细胞中，circPan3增强了编码IL-13受体亚基α1的mRNA的稳定性，从而最终激活了WNT信号通路，这是维持肠干细胞所必需的。

4.2 环状RNA在细胞增殖和肿瘤发生中的功能

全基因组研究表明，前列腺癌和大肠癌细胞系的circRNA水平普遍降低，据报道，circRNA丰度与增殖之间呈负相关，表明circRNA水平可以通过快速细胞分裂来稀释。这一观点得到支持，用激酶抑制剂dinaciclib处理后，前列腺癌细胞增殖减少导致circRNA水平增加了约50％。circRNA在调节细胞增殖中可能独立于其线性同源RNA。据报道，circPOK与其线性同源转录物无关，通过编码转录因子而起着抑癌作用。在间质性肿瘤发生的背景下，circPOK通过共同激活ILF2-ILF3转录因子复合物来充当非编码原癌RNA。在小鼠异种移植模型中，受损或增强的circACC1表达分别通过调节AMPK全酶的酶促活性导致生长抑制或增强。最近的研究表明，由病毒基因组产生的circRNA与细胞增殖和转化有关。例如，卡波西氏肉瘤疱疹病毒circRNA位于病毒裂解基因的开放阅读框中，并通过诱导裂解周期上调来改变细胞生长。

4.3 环状RNA在神经元中的功能

有人指出，circRNA在哺乳动物的大脑中、神经元细胞系、神经产生过程、以及果蝇的神经组织老化中高水平积累。circRNA在神经元中的高表达可能归因于其稳定性，因此在这些缓慢分裂的细胞中积累。例如，在人类ES细胞和人类ES细胞衍生的前脑神经元中，circRNA产生的动力学基本保持不变，但是前脑神经元的circRNA的丰度和多样性都大大增加。此外，许多circRNA在突触形成过程中变得更加丰富，这些观察表明，circRNA可能调节突触功能。在人、小鼠和果蝇之间，一些大脑特异性的circRNA是保守的，表明它们具有调控神经元的功能，可能由于其高度稳定性而与记忆有关。在Cdr1as基因敲除小鼠中，与神经精神疾病相关的兴奋性突触传递功能障碍也支持circRNA在神经元中的重要性。

图5 circRNA在细胞和生理状况下的作用

5 环状RNA的潜在应用价值

环状RNA的共价闭环结构赋予circRNA高稳定性，独特的分子构象，体外合成circRNA还具有潜在的免疫原性。最近一些研究也尝试设计基于环状RNA的细胞功能探测和细胞内过程的操纵工具，调控miRNA功能，阻抑先天免疫效应，增强应答，增强蛋白翻译效率。circRNA还是很好的疾病诊断标志物。

近几年的研究让我们从发现并认识了转录组中的一个新成员circRNA。这种转录产物的存在和一些生物学功能，但还有很多的问题没有认识清楚，包括：

（1）circRNA的表达定位机制还不清楚。特别是不同生物学环境下circRNA特有的生成机制，例如是否存在某种因素只介导了反向拼接，而没有参与正常拼接的过程？

（2）circRNA与线性RNA不同可变剪切方式的机制是什么？

（3）m6A是否参与了circRNA的生成和代谢？

（4）在非压力条件下，circRNA是如何降解的？

（5）究竟有多少功能性circRNA分子存在？这还需要大量的工作来筛选。

（6）表达量如此低的circRNA分子如何有效竞争性结合miRNA，结合蛋白？

（7）特定的circRNA分子翻译的产物是它们的关键功能吗？

（8）体内需要抑制多少量的内源circRNA可以产生表型？

（9）circRNA在天然免疫、大脑及其它生理活动中的作用机制是怎样的？

（10）circRNA-蛋白复合物的主要成分是什么？

（11）新技术，例如CRISPR-Cas碱基编辑，CRISPR-Cas13靶向RNA的技术体系能用于分析circRNA的生成和功能研究吗？能避免对线性RNA的影响吗？

这些问题也是困扰circRNA研究的重要科学问题。

参考文献

（1）Ling- Ling Chen, The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs，Nature Reviews Molecular Cell Biology （2020），https://www.nature.com/articles/s41580-020-0243-y

2020年4月15日，四川大学华西医学院的彭勇教授和魏霞蔚教授为共同通讯作者在Trends in Cell Biology （IF=16.588）杂志上发表了一篇题为“Structure-Mediated Degradation of CircRNAs”的亮点介绍（SpotLight），介绍最近在Molecular Cell报道的由RNA结合蛋白UPF1和G3BP1选择性介导结构复杂circRNA降解的新机制（[1]）。circRNA公众号也曾在第一时间对该进展做了介绍：

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环状RNA（circRNA）是由大量真核基因产生的单链共价闭合RNA环。

它具有组织或发育阶段特异性，在生理和病理过程中都发挥着重要作用。越来越多的证据表明，circRNA通过不同的机制在转录、转录后和翻译水平上控制基因表达，包括作为miRNA海绵，与蛋白质或DNA相互作用以及编码小肽。调控circRNA的产生和降解，对于维持它的细胞内稳态和发挥它的生物学功能是至关重要的，但是circRNA的降解机制尚不清楚。本篇综述回顾了4种circRNA的降解形式，及阐述结构介导circRNA的降解途径。

miRNA以序列依赖性的方式介导AGO2对circRNA的降解

由于circRNA上没有5′-7-甲基鸟苷帽或3′-poly（A）尾巴，因此它可能是通过核酸内切酶诱导的降解。circRNA CDR1as / ciRS-7上存在与miR-671几乎完全互补匹配的位点，募集miR-671，引起AGO2核酸内切酶的切割从而破坏环状结构，再由核酸外切酶对线性RNA进行降解。然而，尚未发现是否其他miRNA介导AGO2降解带有miRNA结合位点的circRNA。

核酸内切酶RNase P / MRP以序列依赖性方式切割含m6A的circRNA

含m6A的circRNA可以使用m6A作为标记物来募集YTHDF2蛋白和HRSP12蛋白。然后，HRSP12直接与circRNA上的GGUUC模式结合，并充当将YTHDF2和核酸内切酶RNase P / MRP结合在一起的桥梁，从而使RNase P / MRP能够启动circRNA的降解。

RNase L依赖circRNA的结构调节其降解

circRNA独特的空间结构使它们能够结合各种蛋白质，从而增加了其降解机制的复杂性和特异性。许多circRNA会形成16-26个碱基对（bp）的RNA双链体，其中的碱基并不是全部配对结合，该双链体与双链RNA（dsRNA）激活蛋白激酶PKR相关。病毒感染后，RNase L（一种广泛表达的胞质核酸内切酶）通过未知机制被激活并降解这些circRNA，从而激活PKR进行先天免疫应答。然而，关于RNase L是如何被募集到circRNA中的，以及circRNA通常是如何以结构依赖的方式降解的，人们知之甚少。

UPF1和G3BP1依赖circRNA的结构调节其降解

在最近的一项研究中，Fischer等人发现了一种RNA降解机制，在正常状况下，高结构的RNA，包括circRNA被选择性的降解。人类三分之一的circRNA被预测可以形成高度整体结构，它们的降解受到两种RNA结合蛋白UPF1和G3BP1的调控。UPF1和G3BP1负责识别和解开circRNA的结构。这种降解途径需要UPF1的RNA结合活性和解旋酶活性，以及G3BP1的RNA结合活性和S149磷酸化(与其核酸内切酶活性有关)。由于这种途径感知的是整个RNA结构，而不是线性的一级结构，所以它被称为结构介导的RNA降解(SRD)。SRD不同于其他UPF1介导的RNA降解，如NMD和Staufen1介导的降解(SMD)，因为这两条途径关键因子的丢失对高结构circRNA的表达几乎没有影响。

生化实验表明，G3BP1只与高结构的circRNA结合，而UPF1既可以与高结构的circRNA结合，也可以与低结构的circRNA结合。此外，在G3BP1基因敲除细胞中进一步敲除UPF1，对高结构的circRNA没有额外的影响，因此表明G3BP1是SRD途径的决定因子。

图1 circRNA的降解途径

参考文献：

[1] YingliGuo, XiaweiWei, and YongPeng. Structure-Mediated Degradation of CircRNAs. Trends Cell Biol. 2020 Apr 15. pii: S0962-8924(20)30072-6. doi: 10.1016/j.tcb.2020.04.001.

本文主要发现UPF1和G3BP1可以介导RNA结构依赖的降解（SRD），这种机制与RNA具体的序列没有直接关系，但与mRNA的3’-UTR的结构有关。一些结构比较复杂的circRNA也可以经过该机制降解。本文的大部分篇幅是介绍如何发现并验证UPF1和G3BP1在mRNA降解中的作用的，仅在最后提到了circRNA也可以与mRNA共享这一降解机制。那么，作者如何发现并证明UPF1和G3BP1在RNA降解中的作用的？可以通过这一机制降解的circRNA有什么特征？

如何发现UPF1和G3BP1介导RNA降解的？

全文首先从UPF1可以结合并解悬RNA的高级结构，并且这些结合的位置常位于mRNA的3’-UTR，由此提出UPF1可能介导mRNA的降解作用，进一步通过分析UPF1结合什么类型的mRNA，这一结合如何调控mRNA的降解，如何通过与G3BP1结合并协同参与靶mRNA分子的降解。

UPF1的CLIP数据（已发表的数据）分析结果表明可被UPF1结合的区域比总RNA的结合自由能更低，具有更多的高级结构。从CLIP的数据中首先挑选了7个3’-UTR 区域结构比较复杂的（HSU）和相对结构简单的（PSU）mRNA基因，这些mRNA的3’-UTR长度接近，可比较性较强。分析敲降UPF1后mRNA的丰度变化，结果显示，3’-UTR结构较复杂的mRNA在敲降UPF1后丰度变化较少，因此得到了初步的结论，UPF1与这类mRNA的降解可能有关系。

图1 UPF1结合3’-UTR结构复杂的mRNA （[1]）

G3BP1和G3BP2均可以与UPF1结合但不与NMD因子有关但与RNA的降解有关。从CLIP数据分析的结果来看，G3BP1也是可以结合3’-UTR结构复杂的mRNA。与UPF1的方法类似，敲除G3BP1也是会导致HSU组的mRNA降解变慢，说明G3BP1与UPF1在3’-UTR结构复杂的mRNA降解过程中有相似的功能。

图2 UPF1调控3’-UTR结构复杂的mRNA的稳定性 （[1]）

UPF1和G3BP1如何介导RNA降解的？

UPF1与G3BP1都参与3’-UTR结构复杂的mRNA的稳定性有关，它们在调控这类RNA降解的机制中是怎样的关系？作者基于单独或共同敲降UPF1和G3BP1，蛋白互作分析证明了UPF1与G3BP1相互作用可以调控靶RNA的降解。有趣的是，作者所发现的这种基于UPF1和G3BP1的RNA降解途径（SRD）与另一种基于3’-UTR的RNA降解机制Staufen-mediated decay （SMD）途径并不相同，因为敲降SMD途径的两个关键因子STAU1和STAU2并不会阻止本文挑选的HSU类RNA降解作用。

图3 UPF1与G3BP1协同靶mRNA的降解 （[1]）

为进一步验证SRD在全基因组水平调控RNA降解的作用情况，作者分析了G3BP1敲除细胞全转录组情况，分析表明受G3BP1敲除影响降解作用的RNA倾向于属于HSU类型的RNA分子，其3’-UTR往往具有更强的碱基互补作用，即更有可能形成更多的高级结构。

图4 受SRD机制调控降解的RNA分子碱基互补情况分析 （[1]）

受UPF1和G3BP1调控降解的circRNA有怎样的特征？

在文章的最后，作者也分析了是否存在受SRD机制调控降解的circRNA。作者首先分析了circBase数据库中所有外显子来源circRNA的二级结构预测情况，其中找出了100个circRNA具有潜在的复杂结构状态，其中有37个在DLD细胞中高表达。分别敲降UPF1和G3BP1分析丰度变化趋势，结果发现，高级结构越复杂的circRNA分子在分别敲降了UPF1和G3BP1后其丰度变化越小，说明存在复杂结构的circRNA分子有可能会受到SRD机制调控。进一步分析表明G3BP1敲除后UPF1敲降不再影响这些circRNA的降解，并且敲降STAU1或STAU2后也不能改变，因此可以排除SMD途径降解的干扰。说明在circRNA中可能存在与mRNA中SRD机制相似的降解途径，但与mRNA中的情况稍有不同，UPF1和G3BP1结合结构复杂和结构简单的circRNA分子的能力略有不同，具体原因还不明确。

图5 受SRD机制调控降解的circRNA分析 （[1]）

本文报道发现了一种新的RNA降解机制，主要基于RNA高级结构实现对RNA分子的降解，SRD机制也可以直接调控circRNA的降解，这增加了我们对circRNA体内调控机制的认识。

参考文献

1. Fischer, J.W., et al., Structure-Mediated RNA Decay by UPF1 and G3BP1. Mol Cell, 2020.