外泌体与微量样品分析 – 888集团浏览器官网 - 888电子游戏 //www.xjpih.com Wed, 21 May 2025 09:37:22 +0000 zh-CN hourly 1 https://wordpress.org/?v=5.1.3 //www.xjpih.com/wp-content/uploads/2019/03/cropped-circRNA（透明）-2-32x32.png 外泌体与微量样品分析 – 888集团浏览器官网 - 888电子游戏 //www.xjpih.com 32 32 circRNA创新疗法的突破与展望 //www.xjpih.com/?p=11627 //www.xjpih.com/?p=11627#respond Thu, 06 Feb 2025 09:02:59 +0000 //www.xjpih.com/?p=11627

近年来，circRNA高质量研究热度攀升。作为下一代RNA药物开发的理想平台，聚焦于circRNA的早筛早诊、预后评估、新型疗法、体外合成工艺及包封递送技术等研究，为circRNA从实验室迈向临床提供了有力支撑。

2024年，中国药企率先发力，推动两款国际领先的circRNA药物实现里程碑式的突破。转录本生物（RiboX）用于治疗放射性口干症的RXRG001疗法；环码生物（CirCode）用于治疗缺血性心脏病的HM2002注射液。先后获得美国FDA和中国NMPA的临床试验许可（IND），circRNA疗法取得跨越式进展。

本文将回顾2024年，circRNA从基础研究到临床转化的进展：

基础研究

  • 新型靶点的挖掘展示精准医疗潜力

  • 生成和转运机制研究提供精准干预策略

  • 编码or非编码生物学功能启发新型疗法

  • 数据信息及分析工具加速研究进程

转化应用

  • 生物标志物研究有望实现早筛早诊及预后评估

  • 疫苗/肿瘤免疫/基因编辑等疗法研究成果丰硕

  • 提升合成工艺及递送策略加速成药进程

 

临床进展

  • 中国两款circRNA药物进入IND阶段

  • 全球管线推进产业升级以加速临床转化

展望

  • circRNA潜力无限且未来可期

基础研究

一 新来源的circRNA

1976年，circRNA分子首次在植物类病毒基因组中被发现，沉寂30余年后，研究者通过高通量测序技术发现其在人体内广泛存在且与生命活动密切相关，circRNA迅速成为备受瞩目的明星分子。自然界中circRNA的种类和复杂性远超人们想象，大量特性和功能仍待探索。2024年，一些新来源的circRNA涌现，为精准医疗靶点挖掘带来新希望。

斯坦福大学Andrew Z Fire团队在人类口腔和肠道微生物组数据中，新发现一类circRNA，命名为“Obelisk（方尖碑）”。Obelisk是介于病毒与类病毒之间的全新元件，可能会改变细菌宿主的基因活动，进而影响人类基因。[1]

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华中科技大学协和深圳医院肖礼祖联合美国罗格斯大学朱桦和霍华德大学唐七义，采用二代和三代ONT测序在水痘带状疱疹病毒（VZV）及其感染的神经母细胞瘤中，鉴定了一种源自VZV潜伏期相关转录本(VLT)的VZV circRNA（circVLTSlytic）。circVLTSlytic在VZV发病机制中发挥重要作用，可以增强VZV对阿昔洛韦的耐药性，使VZV逃避抗病毒治疗，具有作为优化治疗的靶点和作为药效标志物的潜力。[2]

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二 circRNA的生成及转运

circRNA生成

circRNA主要通过反向剪接生成，其过程受多种顺式元件和反式因子调控，这一独特生成过程的精准调控为疾病诊断和治疗提供了新思路。

中国科学技术大学王小林/单革团队发现ZC3H14蛋白可以通过结合成环序列外显子-内含子边界和3’UTR，促进circRNA产生，在雄性生殖中发挥关键作用。深入研究睾丸中circRNA生成机制和功能，有望为不育症的临床治疗提供新的有效治疗策略。[3]

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中南大学朱曲波团队为了增强体内circRNA的生成，利用称为“circRNA促进RNA（cpRNA）”的工具，可以通过补充pre-mRNA中反向互补匹配(RCMs)的侧翼序列，优化外显子环化，从而促进circRNA的形成。cpRNA作为一种极具潜力的circRNA过表达策略，为circRNA表达水平低下引发的疾病提供了有前景的治疗思路。[4]

circRNA转运

circRNA主要在细胞核内生成，大部分转运至细胞质中发挥作用。其出核过程受多种生物学机制调控，动态转运亦影响其功能。circRNA转运机制的揭示为干预circRNA功能的治疗策略提供理论基础。

墨尔本大学Vihandha Wickramasinghe联合阿德莱德大学Gregory Goodall团队发现小分子GTP酶Ran-GTP的梯度，出核受体exportin-2，以及IGF2BP1/2都可调控circRNA的出核。这些分子机制为干预circRNA转运开发疾病疗法提供了可能性。[5]

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随后，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲团队首次发现将circRNA出核调控与功能作用关联。一类腺苷酸富集的circRNA在人源胚胎干细胞H9的细胞核中滞留，并随着定向分化为前脑神经元的过程中出核，其动态定位参与调控蛋白质翻译和神经元的突触生长。[6]

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三 circRNA的生物学功能 

随着技术工具的发展，circRNA更多功能被解锁，作用机制也逐步清晰。功能机制研究为基于circRNA的疾病早期诊断、治疗监测和新型疗法的研发提供了理论支撑和全新思路。

图1 circRNA的生物发生及功能[7]

circRNA翻译

circRNA的可翻译性及其翻译产物的功能是近年的研究热点，其可翻译性是其替代线性mRNA成为下一代RNA疗法的前提。circRNA可由内部核糖体进入位点（IRES）、m6A修饰或外显子连接复合物（EJC）等介导翻译起始。

● 翻译机制研究，优化circRNA药物设计

中科院上海生命科学研究院王泽峰团队基于机器学习算法，预测到大量具有翻译激活子活性的潜在RBP，这些激活因子可促进IRES介导的circRNA翻译。特定的翻译激活因子可调控IRES介导的circRNA在不同细胞环境下的翻译。通过设计在特定细胞中启动翻译的IRES，可得到细胞特异性翻译的circRNA，从而达到精准治疗的目的。[8]

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缺乏终止密码子的circRNA允许核糖体沿circRNA翻译多次，从而产生多聚蛋白，这一过程称为滚动环翻译（RCT）。多聚蛋白可被蛋白酶或自切割序列，在单轮起始中产生多个GOI拷贝。RCT的效率可以是单次翻译的100倍。英国MRC分子生物学实验室Venki Ramakrishnan（2009年诺贝尔化学奖得主）团队设计RCT的circRNA构建，与单次翻译相比，可使蛋白表达高出7,000倍以上。[9]

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● 挖掘潜在编码circRNA，提供治疗诊断靶点

重庆医科大学肖斌团队发现在肾透明细胞癌（ccRCC）中高表达的circPDHK1，可通过编码新蛋白PDHK1-241aa，促进ccRCC的生长和转移。抑制ccRCC细胞中circPDHK1的表达，可以提高细胞对TKIs药物的敏感性。PDHK1-241aa可作为治疗ccRCC的药物研发的潜在新靶点。[10]

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circRNA与mRNA互作

韩国科学技术院Yoon Ki Kim研究团队揭示了circRNA可通过与mRNA的3′ UTR相互作用，将其携带的外显子连接复合体（EJC）定位在mRNA的3′ UTR附近，从而靶向调控无义介导的mRNA降解(NMD)机制。人工设计的circRNA，可靶向下调mRNA水平，为circRNA在基因沉默和疾病治疗中的潜在应用开辟了广阔前景。[11]
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circRNA结合蛋白

circRNA在体内可作为分子海绵招募蛋白，该功能也是人工设计circRNA适配体的大前提。

circRNA可调控染色质的RNA结合蛋白的功能。重庆大学黄川团队发现一类富含金属响应元件的circRNA，可作为trans-acting因子，在铜胁迫过程中与ChRBP gawky特异性结合，调控多种应激胁迫基因转录，并清除受损细胞。[12]

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江苏省人民医院、南京医科大学第一附属医院李相成/李长贤团队发现circPCNXL2通过与STRAP相互作用激活ERK信号通路，调节miR-766-3p/SRSF1轴，促进肝内胆管癌（ICC）生长和转移。circPCNXL2可作为ICC诊断和预后生物标志物，也是一个很有前景的ICC治疗靶点。[13]

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circRNA也可作为支架调节蛋白与蛋白之间的相互作用。复旦大学附属肿瘤医院唐爽/宋少莉团队发现缺氧诱导的外泌体中的circPLEKHM1可以促进PABPC1-eIF4G的相互作用，从而促使巨噬细胞M2极化，加速癌症的转移过程。circPLEKHM1靶向治疗可以显著抑制体内非小细胞肺癌（NSCLC）的转移。外泌体circPLEKHM1可作为潜在的肺癌转移预后生物标志物和治疗靶点。[14]

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miRNA sponge

作为miRNA sponge的circRNA，可通过竞争性结合miRNA，间接调控mRNA的稳定性。南方医科大学南方医院谭万龙团队揭示了膀胱癌来源的外泌体circRNA_0013936，作为miR-320a和miR-301b的分子海绵，上调FATP2的表达，下调RIPK3的表达，从而促进抑制性免疫。circRNA_0013936有望成为膀胱癌的有效治疗靶点。[15]

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四 circRNA数据库

通过优化算法、整合多组学数据以及推动分析技术的创新，可以提升识别和解析circRNA的效率和准确性，为精准医疗和药物研发提供坚实的技术支撑。

TCCIA：由遵义医科大学第二附属医院马虎团队开发的综合性的肿瘤免疫治疗circRNA数据库[16]

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circBank 2.0：由吉赛生物刘明团队开发升级的circRNA信息的综合性数据库，涵盖circRNA保守性、注释、表达信息、miRNA结合位点、验证信息、可视化图、搜索功能、在线分析软件等[17]

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CICADA：由山东省第一医科大学孙亮团队开发，用于预测circRNA的可翻译性与翻译产物[18]

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转化应用

一 circRNA临床检测

针对circRNA生物标志物进行分析，有望实现无创或微创的疾病早筛、早诊及预后评估。circRNA定量检测技术的发展，加速了circRNA作为生物标志物应用于临床检验。

美国Circular Genomics公司公布的首个基于大脑富集circRNA血液生物标志物检测方法，具有预测患者对舍曲林反应，以及SSRI类抗抑郁药物总体反应的能力，有望用于指导准确的个性化治疗。

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福建师范大学冯尚源/林多团队联合福建医科大学附属肿瘤医院许元基团队基于表面增强拉曼光谱联合催化发夹组装技术开发的光学纳米生物传感器，能高效检测血液样本中与肺癌相关的circRNA，为早期肺癌的筛查和治疗提供了新的方法。[19]

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中山大学王佳思团队基于多分散液滴数字CRISPR/Cas13a技术开发的自动化便携式仪器，可通过CRISPR/Cas13a特异性结合circRNA的连接位点区域（BSJ）序列，结合液滴的限域效应实现目标circRNA的现场、自动化、精准定量分析，有望应用于癌症等重大疾病早期诊断。[20]

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二 circRNA创新疗法

circRNA因其固有稳定性使半衰期较线性RNA更长，有望成为持续干预治疗的理想药物。同时，circRNA免疫原性较低，有利于保障疗效与安全性。围绕circRNA的创新疗法开发，正引领核酸药物迈向新的革命浪潮。

图2 工程化circRNA用于蛋白表达。[21]

图3 工程化circRNA的非编码功能应用。[21]

传染病疫苗

circRNA在血液中同样具有较高的稳定性，作为传染病疫苗可提供强大的保护。鉴于mRNA疫苗的成功经验，传染病疫苗将是circRNA的重要的应用方向。

中国科学院广州生物医药与健康研究院冯立强/巫林平/陈凌团队开发的单剂量编码寨卡病毒两种抗原的circRNA疫苗，即可在小鼠体内提供针对寨卡病毒的有效和持久的保护作用，而不会诱导明显的登革热抗体依赖性增强效应。[22]

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中国科学院武汉病毒研究所龚睿/揣侠团队、环码生物王泽峰团队联合中国科学技术大学Sandra Chiu团队开发的混合多种编码猴痘病毒不同抗原的circRNA，可触发针对猴痘病毒的全面、有效保护。[23]

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与线性mRNA相比，较少剂量的自我扩增mRNA（SAM）疫苗即可在较长时间内产生所需数量的抗原。然而，SAM RNA存在序列较长、可能引入突变、免疫原性较高、作用机制不稳定等问题。印度生物技术部转化健康科学与技术研究所Milan Surjit团队揭示了相比SAM，circRNA疫苗更安全地表达SARS-CoV-2-RBD抗原，并提供针对SARS-CoV-2更有效的保护。[24]

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华中农业大学赵凌团队开发整合编码相应抗原和佐剂趋化因子配体CXCL13的circRNA疫苗，可以增强针对流感病毒、SARS-CoV-2的交叉反应抗体提供更广泛的保护，还可针对狂犬病毒提供全面的保护。[25]

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中山大学公共卫生学院（深圳）陈耀庆/舒跃龙团队联合湖南大学郑克威团队，利用circRNA编码含有N1、N2和乙型流感病毒NA抗原的circRNA疫苗，可以引发针对异源流感的广谱NA免疫，对开发广谱流感疫苗，并控制流感和防范潜在的大流行至关重要。[26]

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肿瘤疫苗

肿瘤疫苗类型包括肽/蛋白、树突状细胞(DC)和核酸(包括DNA和RNA疫苗)。其中RNA疫苗可在细胞质内快速表达抗原，从而导致强大的免疫激活，还可避免基因组整合和T细胞耐受性相关风险。加之circRNA的独特优势，可成为极具前景的肿瘤疫苗载体。

斯坦福大学的张元豪和Wender研究团队利用circRNA编码卵清蛋白 (OVA)[27]，多伦多大学李博文团队利用circRNA编码IL-12[28]、福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙/赵必星团队利用circRNA编码新抗原PTPN2多肽片段[29]，结果发现这些circRNA肿瘤疫苗均可在模型体内诱导强烈的抗肿瘤免疫反应，且能强效、安全、稳定抑制肿瘤生长，甚至清除肿瘤，效果显著优于线性mRNA，且无明显副作用。

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中山大学附属第一医院张弩团队联合吉赛生物团队开发表达lncRNA编码肽肿瘤抗原的疫苗circH19-vac，可触发针对胶质母细胞瘤的强效细胞毒性T细胞反应并抑制肿瘤生长。[30]

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circRNA还有望成为优越的肿瘤抗原载体，开发有效的DC疫苗。吉林大学张海红团队开发编码肿瘤抗原FAPα和survivin的circRNA DC疫苗，可显著抑制肿瘤生长，与吉西他滨药物进行联合治疗，显著延长了胰腺癌小鼠的存活率。[31]

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图4 circRNA疫苗激活免疫反应。[32]

CAR-T疗法

基于circRNA的CAR-T疗法可避免传统技术的病毒载体、基因组整合和永久转基因表达所带来的风险。复旦大学章旭耀联合美国宾夕法尼亚大学华先欣研究团队表明利用circRNA编码anti-CD19 CAR具有比mRNA更优越的抗肿瘤功效。[33]

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circRNA还为体内CAR-T疗法提供了优秀的平台，复旦大学璩良团队利用免疫细胞趋向性的LNP体内递送编码anti-HER2 CAR蛋白的circRNA，可显著抑制肿瘤生长，并诱导促炎症肿瘤微环境，联合肿瘤疫苗还可协同增强抗肿瘤活性。[34]此外，环码生物杨赟联合北京大学邓觅/苗蕾团队，利用编码anti-uPAR CAR蛋白circRNA，可在单核/巨噬细胞和衰老成纤维细胞中有效表达，具有治疗肝纤维化和类风湿性关节炎等炎症性衰老的潜力。[35]

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蛋白替代疗法

circRNA可长效稳定表达蛋白，可突破蛋白疗法不稳定或容易导致不耐受的限制。科锐迈德孙振华、普瑞康生物曹辉联合东南大学-莫纳什大学联合研究院佟振博团队向间充质干细胞转染编码FGF18蛋白的circRNA，可在大鼠骨关节炎模型中显著促进了软骨修复。[36]

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东南大学李新松团队联合东南大学附属中大医院郭宗科团队开发的单剂U-LNP/VEGF-A circRNA制剂即可原位长效表达和释放VEGF-A，第12天即可使小鼠糖尿病创面几乎完全愈合，效果显著优于线性VEGF-A mRNA和rhVEGF。[37]

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此外，中山大学中山眼科中心谢志团队利用circRNA编码NGF，可显著提高视网膜神经节细胞的存活率，效果远优于重组NGF蛋白治疗，为治疗青光眼等视网膜神经退行性疾病提供了新的希望。[38]

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干细胞疗法

美国加州大学Prashant Mali团队将编码分化调控因子的circRNA转染至多能干细胞，可精准调控其分化方向，为干细胞工程的应用与发展开辟了全新的道路。[39]

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基因编辑

基因编辑疗法可以通过纠正致病突变，治疗遗传病。RNA介质的短效编辑器为瞬时表达，可避免由基因编辑器持续作用所带来的脱靶效应的累积，保证了疗法的安全性；circRNA相比线性RNA稳定性更高，免疫原性更低，保证了基因编辑疗法的有效性。利用circRNA编码CRISPR/Cas或锌指蛋白等编辑蛋白，或设计环状引导RNA，共同为基因编辑疗法提供了新策略。

● circRNA编码编辑蛋白

美国加州大学Prashant Mali团队利用circRNA编码DNA甲基转移酶DNMT3A-3L和ZF-KRAB融合蛋白，可有效抑制与心血管疾病风险有关的PCSK9的表达。利用circRNA编码CRISPRoff系统的核酸酶失活Cas9（dCas9）、KRAB、DNMT3A-3L融合蛋白通过表观组编辑，可在sgRNA的引导下特异性抑制B2M基因。[39]

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此外，中国台湾国家卫生研究院余佳益团队利用circRNA编码修饰的Cas13以靶向ER (erCas13)，在sgRNA的引导下，可显著降低黄病毒感染水平。[40]

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● 引导编辑器

中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队在circRNA中串联置入靶向多个位点的多个crRNA，以及靶向多个位点的RTT-PBS序列，可引导基于Cas12a开发的引导编辑器系统在人类细胞系中同时编辑多达四个基因。[41]

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另外，德国美因茨分子生物研究所Edward A. Lemke团队利用环状gRNA引导的假尿嘧啶合成酶dyskerin（DKC1）构建人工膜样细胞器，可以显著增强mRNA假尿嘧啶修饰，并通过Ψ修饰靶向抑制终止密码子，可用于治疗遗传性果糖不耐受等过早终止密码子疾病。[42]

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适配体

适配体是细胞中表达的短结构DNA或RNA，用于结合特定靶标并操纵细胞内过程。circRNA具有高稳定性、特殊折叠和低免疫原性，且内源性circRNA也可与特定蛋白相互作用，因而circRNA具备改造为新型RNA适配体的潜在生物医学应用前景。

陈玲玲团队利用腺相关病毒（AAV）将具有短双链结构的circRNA（ds-cRNA）适配体递送到神经元和小胶质细胞中，能够安全且有效抑制过度激活的蛋白激酶R（PKR），实现对阿尔茨海默病小鼠的神经保护、增强其空间学习和记忆能力。[43]

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类似地，陈玲玲团队利用靶向脾脏的LNP递送ds-cRNA适配体，可实现PKR异常激活相关的炎性疾病小鼠模型银屑病的干预治疗。[44]

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发挥内源性circRNA功能

针对功能性内源性circRNA治疗靶点，通过干预内源性circRNA的表达，可以开发更多创新疗法。

中国人民解放军总医院付小兵/张翠萍联合中山大学附属第七医院李海红团队发现含高丰度内源性circCDK13可通过形成circCDK13-IGF2BP3-mRNA复合物，稳定并上调CD44和c-MYC的表达。设计高丰度circCDK13的工程化EV，能促进糖尿病小鼠模型的伤口愈合。[45]

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江苏省肿瘤医院许林/董高超/蒋峰团队发现肺腺癌中cEMSY可作为免疫原性细胞死亡诱导剂，瘤内给药cEMSY-LNP使LUAD细胞对anti-PD-1治疗增敏，提高肺腺癌的免疫治疗效果。[46]

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三 circRNA制备工艺及递送策略

工程化circRNA的大规模制备、纯化及高效递送是其临床转化的关键瓶颈。2024年，众多研究团队针对这些关键难题提出解决方案，优化合成工艺，攻克成药难题，为circRNA的临床应用扫清障碍。

circRNA环化策略

目前已经开发了多种circRNA环化策略，以核酶环化法最为常用，多项研究基于这个策略进行了技术升级。

● I型内含子自剪接法

清华大学喻国灿、新加坡国立大学永禄林医学院陈小元联合山西高等创新研究院刘志达团队，基于I型内含子建立的增强型嵌合PIE系统（CPIE系统），可实现RNA高效环状化，最大限度减少circRNA中残留多余序列。[47]而复旦大学章旭耀团队联合美国宾夕法尼亚大学华先欣团队同样基于I型内含子建立的Hi-Scarless-PIE实现了circRNA的量产、无痕（no scar）制备。[45]

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● II型内含子自剪接法

美国加州大学Prashant Mali团队基于II型内含子开发的平台可以有效体外制备circRNA (ocRNA)，还可以利用内源性普遍表达的RtcB蛋白在细胞内环化生成circRNA (icRNA)。[39]

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● 顺式作用连接酶核酶法

中国台湾国家卫生研究院余佳益团队利用系统筛选的顺式作用连接酶核酶（RzL）对单链RNA进行共价环化，最小化了RzL作用所需的RNA序列，RzL策略高度依赖于酶-底物RNA配对产生circRNA，因而没有RNA副产物。[40]

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艾博生物英博团队开发高效成环顺式剪接系统（Cis系统），可延长蛋白表达时间、降低免疫原性，并具有剪接位点设计灵活性等优势。[48]

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● 反式作用连接酶核酶法

英国MRC分子生物学实验室Venki Ramakrishnan团队基于反式核酶开发TRIC和TERIC的RNA环化方法，可以实现RNA的高效环化，提高产量，且可合成长序列和完全修饰的circRNA。[9]

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● RNA LEGO

此外，麻省理工学院化学系/Broad研究所王潇团队基于多种连接酶的mRNA-寡聚核苷酸组装策略（RNA LEGO），对circRNA化学修饰和拓扑结构改造，大幅提高了其在小鼠体内的蛋白生产能力，为mRNA翻译起始机制及相关化学修饰设计提供了新见解。[49]

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纯化策略

circRNA因合成策略复杂及多样化，纯化仍是制备的关键难题。目前，纯化策略主要包括核酸外切酶去除线性RNA杂质，磷酸酶中和免疫原性三磷酸基团，以及凝胶电泳、HPLC、亲和层析和超滤等分离技术。然而，开发circRNA新疗法需优化大规模纯化策略，以实现高纯度和高产量。

中国食品药品检定研究院徐苗团队建立RT-HPLC纯化法，明显分离circRNA、nicked RNA和precusorRNA，可用于分析circRNA疫苗纯度及降解产物。同时，研究还发现在热加速稳定性实验中，circRNA 降解模式为：

circRNA→Nicked→RNA降解片段。[50]

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西班牙 Certest Biotec S.L公司团队在circRNA序列中添加PloyA，利用Oligo dT亲和层析技术纯化circRNA，得到circRNA的占比更高，且在细胞水平和体内的表达效果均优于kit试剂盒以及HPLC纯化得到的circRNA。[51]

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中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室曹宇虹团队利用纤维素过滤去除dsDNA，结合酶处理的逐步纯化策略，用于circRNA纯化，显著提高circRNA回收率，降低免疫原性。[52]

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类似地，美国克莱姆森大学Scott M. Husson团队利用聚醚砜（PES）膜从IVT产物中超滤纯化circRNA，大幅提升纯度及产率，突出了超滤在研究规模上是一种优越的circRNA纯化方法，也可以在基于circRNA的治疗药物的大规模生产中发挥关键作用。[53]

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递送策略

基于mRNA疫苗的成功经验，纳米脂质颗粒（LNP）已成为当前主流的RNA递送系统。然而，针对circRNA更高效、精准和安全的递送需求，LNP体系仍需进一步优化。优化策略主要包括调整脂质比例、改变脂质特性以及添加非脂质成分等。综合成本、疗效与安全性，改变脂质特性成为当前较主流的策略。

● 添加非脂质成分LNP

华中农业大学赵凌团队利用马来酰亚胺/硫醇将anti-DEC-205抗体共轭修饰到LNP，可促进靶向淋巴结递送circRNA。[25]

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● 改变脂质特性LNP

多伦多大学李博文团队引入组合化学的Ugi四组分反应合成并筛选针对特定肿瘤定制的LNP，在肺癌细胞中转染circRNA疫苗的效率比行业标准LNP（ALC-0315）提高了四倍，同时提供了有效的免疫激活。[28]

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环码生物杨赟联合北京大学邓觅/苗蕾团队开发含有新型拟心磷脂磷酰胺脂质的LNP，增加了硬度和相分离，促进T细胞偏向性摄取。[35]

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复旦大学璩良团队通过改造LNP中阳离子脂质头部和尾部基团，可得到免疫细胞趋向性的LNP体内有效递送circRNA。[34]

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科锐迈德孙振华、普瑞康生物曹辉联合东南大学-莫纳什大学联合研究院佟振博团队具有支链尾部和五个酯键的专有可电离甘油脂质（TG6A），使用TG6A构建的LNP成功向间充质干细胞转染circRNA。[36]

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● GSer-CARTs

除了LNP这种典型多阴离子转运体外，斯坦福大学张元豪和Wender团队还有研究通过电荷抵消动态控制胍离子活动性开发的肝外靶向、可调控、可预测的GSer-CARTs转运体，实现了circOVA的体内高效递送。[27]

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临床进展

circRNA的临床转化，既依赖基础研究突破，也需要产业生态推动。2024年，行业协同发力，融资为产业发展注入动力，广泛合作带来前沿理念与创新思维，circRNA药物开发事业迈向新高度。

一 临床试验阶段

FDA批准首个IND
转录本生物（RiboX）（中国）

转录本生物在研疗法RXRG001的IND获得许可，即将在美国开展临床试验SPRINX-1。RXRG001是全球首个获美国食品药品监督管理局（FDA）批准进入IND的circRNA疗法，SPRINX-1试验将评估其在辐射诱导的口干症和唾液分泌减退患者中的安全性和有效性。

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NMPA批准首个IND
环码生物（CirCode）（中国）

环码生物用于治疗缺血性心脏病的HM2002注射液在上海交通大学医学院附属瑞金医院开展IIT试验并完成首例患者注射给药。三个月后，HM2002注射液成为中国首个获得国家药品监督管理局（NMPA）临床试验许可（IND）的环形RNA药物。

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截至本文发布日，CirCode官网公布的管线分布与进展

二 临床前研究阶段

Orna Therapeutics（美国）

Orna Therapeutics在2024年收购ReNAgade Therapeutics，双强携手推进用于治疗肿瘤和自身免疫性疾病的新型体内RNA疗法panCAR项目的开发。在ESGCT年会上，Orna展示了研究数据：来自健康供体的原代造血干细胞祖细胞（HSPC）的编辑率显著提高到约80%。Orna的STEM技术旨在解决β血红蛋白病，包括镰状细胞病（SCD）和输血依赖性β地中海贫血（TDT）。

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截至本文发布日，Orna Therapeutics官网公布的管线分布与进展

Sail Biomedicines（美国）

Sail Biomedicines宣布获得比尔&梅林达·盖茨基金会的两笔赞助，用于推进Endless RNA™平台开发治疗疟疾的分泌型单克隆抗体和疫苗。随后，Sail Biomedicines公布Endless RNA™平台可能为那些不适用现有治疗的10%-15%囊性纤维化患者提供治疗选择。

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截至本文发布日，Sail Biomedicines官网公布的管线分布与进展

Circular Genomics（美国）

Circular Genomics在新年伊始完成2024年circRNA全球领域的首笔融资，为推出全球首个基于circRNA的临床检测做准备。Michael F. Ackermann博士的加入，将为其助推首个circRNA抗抑郁疗法。

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截至本文发布日，Circular Genomics官网公布的管线分布与进展

Circio（挪威）

Circio除了开发针对KRAS突变的癌症疫苗外，还建立了circRNA平台circVec，利用DNA和病毒载体生产多功能circRNA。在2024年第27届ASGCT年会上，Circio展示了circRNA与线性mRNA相比在体内的优越性，以及Circio的“移除和替代（remove-&-replace）” 基因疗法的技术概念验证，该疗法可满足α1－抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）的医疗需求。

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截至本文发布日，Circio官网公布的管线分布与进展

Ginkgo Bioworks（美国）

Ginkgo Bioworks收购用于序列设计的人工智能平台Patch Biosciences，以加强其研发管线，强化circRNA和启动子筛选平台技术。

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休斯顿卫理公会研究所（美国）

全球卫生非营利组织流行病防范创新联盟（CEPI）与美国休斯顿卫理公会研究所（HMRI）合作，重点关注circRNA候选疫苗的设计和临床前评估，为疫苗平台建立临床前概念验证。

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展望

2024中国龙年，circRNA领域从基础研究，到转化应用都取得了丰硕成果，circRNA药物开发更是实现了临床里程碑式的突破，振奋人心。然而，circRNA创新疗法的未来发展仍面临诸多问题与挑战。

circRNA转化应用研究有待加强

作为新型核酸技术，circRNA创新疗法在序列设计、翻译效率、功能机制、免疫原性等关键领域的研究尚不够深入，有待进一步挖掘。这需要借助空间多组学技术以及人工智能等多学科的交叉融合，全方位深入挖掘circRNA的功能特性。创新疗法的开发方向不仅局限于蛋白表达，还应拓展基因编辑工具、核酸适配体等药物开发方向，为创新治疗提供更多靶点与策略。

circRNA共性关键技术亟待攻克

工程化circRNA的合成、纯化与递送策略，虽解决方案多样，但个性化特征明显，缺乏统一且高效的通用模式。在原液放大生产环节，需筛选并开发更优的序列设计、环化及纯化策略，以提高产量，同时降低副产物生成。在药物递送环节，亟需开发出安全性更高、效率更优且靶向性更强的递送材料，以满足不同适应症的多样化需求，切实解决circRNA药物递送的关键瓶颈问题。

政策支持与监管机制需加速完善

中国两家企业的circRNA药物获得IND批准，充分彰显了我国在circRNA药物研发领域处于全球领先地位。如何保持领先优势，加速推进产业化，成为摆在眼前的重要课题。政策层面，需加快推进以疾病预防与治疗为导向的临床转化研究，大力支持研究者发起的临床研究（IIT），加速创新疗法安全性与有效性的验证。监管层面，要持续完善相关审评审批程序，加快制定并出台circRNA临床审批标准，推动circRNA前沿技术的产业化进程。

尽管circRNA领域挑战重重，但circRNA疗法未来前景依然可期。期待学术界、产业界与投资界携手共进，让circRNA“暗物质”发出光芒，造福人类健康。 

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=11627 0 Pharmacol Ther丨杨晓峰教授综述circRNA在心血管和代谢性疾病中的研究进展 //www.xjpih.com/?p=9553 //www.xjpih.com/?p=9553#respond Fri, 07 Apr 2023 05:59:52 +0000 //www.xjpih.com/?p=9553
引言

环状RNA(circRNA)作为真核细胞中存在的内源性非编码RNA，具有广泛的表达水平。circRNA具有共价闭环结构，没有5’−3’，极性或多腺苷化的尾巴，比线性RNA更稳定。大多数circRNA，包括外显子circRNA，存在于细胞质中，而保留内含子的circRNA位于细胞核内。circRNA在物种间高度保守，具有microRNA反应元件(MRE)，使它们能够与miRNAs相互作用并调节基因表达。circRNA可以在转录和转录后调节中发挥作用。然而，关于circRNA在心血管和代谢性疾病相关的血管炎症中的作用知之甚少。而鉴于以上circRNA在不同疾病中的重要作用，circRNA的新疗法的开发可能有助于减轻与心血管和代谢性疾病相关的血管炎症。

 

2022年4月，美国心血管研究中心杨晓峰教授在Pharmacol Ther上发表了题为Circular RNAs are a novel type of non-coding RNAs in ROS regulation, cardiovascular metabolic inflammations and cancers的综述。

 

 

一、核糖核酸介绍

细胞核糖核酸(RNA)可分为两类：编码和非编码RNA。非编码RNA(ncRNAs)是从DNA转录而来的功能性RNA，但不能翻译成蛋白质。这些ncRNAs根据其大小可分为两类，大于200个核苷酸的ncRNAs被归类为长非编码RNA(Long Non-Coding RNAs，LncRNAs)，小于200个核苷酸的ncRNAs被归类为小ncRNAs。小的ncRNAs还可以进一步分为：

microRNAs(miRNAs)

小干扰RNAs(siRNAs)

小核RNAs(snRNAs)

小核仁RNAs(snoRNAs)

piwi相互作用RNAs(piRNAs)

转移RNAs(tRNAs)

核糖体RNAs(rRNAs)

图1 核糖核酸的分类

 

二、circRNA生物发生

circRNA生物发生为传统的mRNAs生成增加了一个修饰步骤。前体信使核糖核酸(pre-mRNA)的剪接是由典型的剪接体机制催化的，以去除转录本中的内含子并连接外显子，从而形成具有5’−3’极性的线性信使核糖核酸。外显子circRNAs通常位于细胞质中，但内含子和外显子circRNAs留在细胞核中。

图2 circRNA的生成机制

 

circRNA形成模型

到目前为止，已经提出了四种不同的circRNA生物发生的假设模型包括：(I)内含子配对驱动的环化；(Ii)RNA结合蛋白(RBP)驱动的环化；(Iii)外显子跳过；以及(Iv)内含子套索环化。

图3 circRNA的形成模型

 

三、circRNA的分类

在circRNA中主要分为三个主要亚类。

(A)外显子circRNAs（ecircRNAs）

只包含外显子(s)（通常小于5个），是circRNA类中最重要的一类。ecircRNA具有细胞质位置，可能调节microRNA和蛋白的功能。

(B)外显子-内含子circRNAs（EIciRNAs）

由外显子和保留的内含子组成。EIciRNAs具有核定位，并已被发现能够顺式调控基因转录，也可能是反式调控基因转录。

(C)内含子circRNAs（ciRNAs）

来源于内含子套索，积累在细胞核中，以顺式调控基因转录。

图4 circRNA的分类

 

四、circRNA的生物学功能和机制

近些年来，circRNA的生物学功能已成为科学研究的热点。越来越多的证据表明，除了作为miRNA海绵外，circRNA的其他几个角色也被提出——蛋白海绵、诱饵、支架和招募者。除此之外，通过加强与RNA聚合酶II的结合，位于细胞核的circRNA可以调节其宿主基因的转录，并调节选择性剪接、转录和翻译。

1、circRNA可以作为miRNA海绵

●大多数circRNA位于细胞质中，表明它们参与了转录后调控——作为miRNA海绵或竞争性内源RNA(ceRNAs)，与miRNAs竞争结合mRNA靶标，从而间接调节mRNA翻译。miRNAs与mRNAs的3′-非翻译区结合可导致mRNA降解或抑制蛋白质翻译。

2、circRNA可作为RNA结合蛋白(RBP)海绵

●circRNA可以作为蛋白质海绵，为特异性RBP提供结合位点，通过竞争性抑制来隔离和抑制蛋白质的生物活性。这一过程可能会间接影响其靶标mRNAs的命运。在最近的一项研究中，TTP海绵circRNA被发现在小鼠模型中增强全身炎症。CircFoxo3可以与蛋白质相互作用，抑制细胞周期进程，调节心脏衰老。

3、circRNA可以调节翻译和选择性剪接

●circRNA可以结合开放阅读框架(ORF)被翻译成蛋白质片段，这需要IRES的介导作用亦或是m6A的修饰。circRNA能够翻译的原因也可能是细胞对环境应激源的反应，刺激circRNA翻译蛋白。此外，一些circRNA可以调节其相关线性mRNAs的翻译。

4、circRNA作为基因表达调控因子

●circRNA和线性RNA在生物合成上相互竞争，circRNA可以调节线性RNA的表达。某些circRNA，如ciRNAs和EIciRNAs，通过与基因启动子区域的U1 Snrpn和RNA聚合酶II结合，促进亲本基因的转录。

5、circRNA的降解和消除

●circRNA具有高度的稳定性，半衰期长；因为它们的环状结构，使得它们可抵抗RNase核酸外切酶。目前，对于circRNA如何在体内降解的机制知之甚少。已有研究报道，RNase L可降解circRNA。亦有研究表明RNA修饰、N6甲基腺苷(m6A)以及聚(I：C)刺激可介导内切核酸酶RNase L的激活，并最终导致mRNAs和circRNA的降解。

图5 circRNA功能和降解的示意

 

五、研究circRNA的方法

自从circRNA被发现以来，已经开发了各种生化工具来检测和验证它们的存在、定位、生物发生、生物学功能、疾病含义、相互作用的分子和治疗潜力。还开发了生物信息学工具和统计方法来量化circRNA的表达水平，并高置信度地识别新的circRNA。高通量circRNA测序(CIRC-SEQ)分析、微阵列高通量分析、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、数字液滴聚合酶链式反应(DdPCR)、Northern印迹分析和RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)结合高分辨率显微镜是用于研究circRNA的一些技术。还开发了几个在线circRNA资源和公共数据库，以提供有关circRNA的关键生物信息学知识。目前正在研究circRNA对各种疾病的潜在治疗用途，并正在开发用于circRNA操作的分子工具。为了研究circRNA，已经发展了circRNA过表达(功能放大)和敲低(功能丧失)方法，例如使用包含circRNA序列并由病毒载体系统递送的表达载体、非病毒策略、小干扰RNA(siRNA)和小发夹状RNA(shRNA)。

 

六、外泌体circRNA

circRNA高度稳定，不易降解，如果不加以控制，它们可以在细胞内积累。外泌体是大多数细胞类型分泌的膜结合囊泡，circRNA可以被包含其中，在细胞间发挥通讯和信号转导作用。2015年，Li等人首次报道了外泌体中含有丰富的circRNA。这些circRNA在RNase R处理后仍然在血清中稳定存在。另有研究表示，许多外泌体circRNA可以被释放到细胞外并在血液中检测到，被用作癌症的潜在生物标志物。

图6 exo-circRNA的产生

 

七、circRNA作为潜在的诊断生物标志物
生物标记物在疾病的早期检测中是有用的，而circRNA由于其丰富性、稳定性、组织特异性表达和存在于外泌体中而有望成为疾病生物标记物。

一些circRNA如hSA_CIRC_002059和hSA_CIRC_104916在胃癌组织中表达下调，可作为潜在的诊断生物标志物。

 

八、circRNA对血管炎症的调节作用
内皮功能障碍和血管炎症与多种病理过程有关，如炎症、缺血性心血管疾病以及代谢紊乱。内皮细胞是一种条件性先天免疫细胞，具有危险/病原体相关分子模式的受体，使它们能够感知各种潮湿和条件性潮湿。靶向血管内皮细胞功能障碍和炎症在预防和治疗血管并发症方面具有巨大的治疗潜力。一些证据表明，circRNA在不同的心血管疾病中都有表达，通常与内皮功能障碍、血管平滑肌细胞增殖和迁移以及血管炎症有关。circRNA通过miRNA海绵作用参与心血管疾病，从而调节其靶基因以维持内环境平衡。其中一些circRNA(促炎性circRNA)促进内皮功能障碍、血管炎症和心血管疾病，而另一些circRNA则有抑制作用。

图7 已报道的促血管炎症和心血管疾病circRNA的总结

 

“结论

circRNA是RNA研究的一个新的重要领域。它们是一种多样性、稳定性和保守型的RNA，具有调节作用，但其确切的功能和机制尚不完全清楚。circRNA已被证明作为miRNA和RBP海绵，调节转录和基因表达，并具有潜在的治疗用途。最近的circRNA数据库提供了关于组织特异性表达谱和调控网络的信息。这些见解表明，调节特定组织和细胞中circRNA的表达可能有助于减少与心血管和代谢性疾病相关的内皮功能障碍和炎症。

 

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9553 0 外泌体circRNA促进了PCa的肿瘤发生，为前列腺癌提供了一个新治疗靶点！ //www.xjpih.com/?p=9263 //www.xjpih.com/?p=9263#respond Wed, 15 Feb 2023 09:24:01 +0000 //www.xjpih.com/?p=9263
前列腺癌(PCa)是男性最常见的实体器官恶性肿瘤。前列腺特异性抗原(PSA)在做PCa筛查试验时，往往导致患者的过度诊断和过度治疗[1]。并且，大约30%的前列腺癌病例会发展为转移性前列腺癌。因此，迫切需要探索PCa发展背后的详细机制。环状RNA (circRNA)具有独特的共价单链闭环结构。高通量测序已经确定许多circRNAs在细胞中具有关键的生理和病理作用。circRNAs可以通过结合和隔离microRNAs(miRNAs)来发挥其功能，也可以与RNA结合蛋白(RBPs)相互作用，甚至可以通过m6A依赖的转译来编码独特的肽[2]。在功能上，环状RNA参与许多生理过程，如维持干细胞多能性，控制细胞分化，调节细胞周期和凋亡，以及血管生成。然而，circRNA在PCa中的功能仍然知之甚少。

2022年12月，浙江大学医学院邵逸夫医院泌尿科薛定伟教授在Clinical and Translational Medicine发表文章Exosome-derived circTFDP2 promotes prostate cancer progression by preventing PARP1 from caspase-3-dependent cleavage。与PCa相关的circRNA—circTFDP2在PCa组织和细胞系中都上调。circTFDP2通过与PARP1相互作用并阻止其发生caspase-3依赖性的分裂，从而促进PCa细胞的增殖和转移。结果表明，RBPs的eIF4A3可调节circTFDP2的进展。此外，外泌体传递的circTFDP2在体内和体外都促进了PCa的肿瘤发生。本研究为前列腺癌提供了一个有前景的治疗靶点。

一、 circTFDP2在PCa中高表达

作者经过在50对PCa肿瘤和癌旁样本中筛选circRNA，发现hsa_circ_0008304蛋白来源于TFDP2，被命名为circTFDP2，在PCa样品中显著上调；circTFDP2表达与Gleason评分呈正相关；circTFDP2在转移灶的PCa患者中高表达。这些数据证实circTFDP2在前列腺癌中表达上调。Sanger测序确认circTFDP2的环化位点。背靠背验证其成环；放线菌素D验证其稳定性；核质分离和FISH鉴定其定位于细胞核和细胞质。这些数据证实了circTFDP2是一个环状RNA。

 

图1. circTFDP2的筛选过程及特性

 

二、 eIF4A3在PCa中调控circTFDP2的生物发生

先前的研究表明，几种RBP可以调节circRNA的产生。因此，作者使用circinteractome数据库(https://circinteractome.nia.nih.gov/)识别了circTFDP2侧翼区域的潜在RBP位点和circTFDP2侧翼区域的两个假定eIF4A3结合位点。RIP实验证明eIF4A3与circTFDP2的侧翼区域结合。因此，作者假设eIF4A3控制circTFDP2的生物基因。过表达eIF4A3增强了circTFDP2的表达，而下调eIF4A3则降低了其表达。接下来，作者在50对PCa组织中检测了eIF4A3的表达，结果表明，与正常组织相比，eIF4A3在PCa组织中高表达。总之，这些数据揭示了eIF4A3在PCa组织中调控circTFDP2的生成。
 

图2. eIF4A3在PCa中调控circTFDP2的生物发生

 

三、circTFDP2促进PCa细胞增殖，抑制其凋亡并促进PCa细胞迁移

为了探索circTFDP2在PCa中的具体作用，设计了circTFDP2特异性siRNAs和过表达质粒，并转染到PCa细胞中。敲低circTFDP2显著降低PCa细胞的增殖能力，而过表达circTFDP2则增强了PCa细胞的增殖能力，降低凋亡；而circTFDP2过表达结果相反。WB结果表明，敲低circTFDP2增加了cleaved caspase-3、PARP1和Bax的表达，降低了Bcl-2的表达；circTFDP2过表达结果相反。随后，作者通过建立裸鼠异种移植瘤模型，在体内检测了circTFDP2的致癌作用。结果表明，circTFDP2的下调显著抑制了体内肿瘤的生长；过表达circTFDP2有相反结果。随后，作者评估了circTFDP2在PCa细胞转移中的作用。Transwell检测显示，敲低circTFDP2显著降低了PCa细胞的侵袭和迁移能力，而过表达则相反。此外，裸鼠转移模型的结果与细胞结果一致。综上表示，circTFDP2促进PCa细胞增殖，抑制其凋亡并促进PCa细胞转移。

 

图3. circTFDP2促进PCa细胞增殖，抑制其凋亡并促进PCa细胞转移

 

四、 circTFDP2与PARP1相互作用并阻止其裂解

为了确定circTFDP2调控PCa进展的分子机制，我们首先分析了circRNADb数据库(http://reprod.njmu.edu.cn/cgibin/circrnadb/ circrnadb .php)。结果显示，circTFDP2不存在内部核糖体进入位点(IRES)或开放阅读框(ORF)区域，提示circTFDP2蛋白编码潜力较低。随后，由于circTFDP2同时位于细胞核和细胞质中，猜测circTFDP2可能具有miRNA海绵的功能。但AGO2-RIP实验表明，circTFDP2不能与AGO2蛋白相互作用，表明其不能作为miRNA海绵。

接下来，作者设计circTFDP2探针进行pulldown实验，发现有26个蛋白与circTFDP2特异性相互作用。在这些RBP中，PARP1由于可以抵抗前列腺癌症，被选为潜在的下游。PARP1-RIP实验证实了PARP1与circTFDP2之间的相互作用。FISH和IF检测确定了PARP1和circTFDP2之间的共定位。这些数据表明circTFDP2和PARP1在PCa细胞中形成了RNA蛋白复合物。

基于PARP1和circTFDP2之间的相互作用，作者研究了PARP1是否影响circTFDP2的表达。结果显示，circTFDP2的过表达或敲低都不能改变PARP1的表达和定位，这表明circTFDP2在转录后水平上没有调节PARP1的表达。

但是，由于circTFDP2与PARP1结合，而PARP1的DNA结合区被活跃的caspase-3识别并切割，作者假设circTFDP2影响这一过程。

WB实验显示，过表达circTFDP2会降低裂解PARP1的表达，而敲低circTFDP2则会增加裂解PARP1的表达；circTFDP2敲低的PCa细胞中增强的PARP1裂解被caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK阻断，表明circTFDP2阻止了PARP1依赖caspase-3的活性裂解。上述数据表明circTFDP2可以减弱PARP1的裂解。

 

图4. circTFDP2与PARP1相互作用并阻止其裂解

 

五、 PARP1促进前列腺癌细胞增殖和迁移

PARP1是PARP中最重要的成员之一，参与应激反应、DNA修复和细胞凋亡等多种细胞过程。由于circTFDP2与PARP1结合并阻止其分裂，作者检测了50对PCa肿瘤和癌旁中PARP1的表达。结果显示，PARP1在PCa组织中高度表达。使用TCGA数据库进行分析后，得到了相同的结果。CCK-8和transwell结果显示，敲低PARP1显著降低了PCa细胞的增殖和迁移能力，而反之则反。这些数据说明PARP1促进了PCa细胞的增殖和迁移。
 

图5. PARP1促进前列腺癌细胞增殖和迁移

 

六、circTFDP2通过PARP1调节前列腺癌细胞的DNA损伤

由于PARP1是单链断裂修复的重要分子，作者推测circTFDP2也可能通过阻止PARP1的切割来影响DNA损伤修复。WB和IF检测发现，PARP1过表达降低DNA损伤标志物yH2A.X表达，反之则反。而circTFDP2的过表达减轻了PCa细胞的DNA损伤，敲低circTFDP2的抑制加重了DNA损伤，表明circTFDP2参与了PCa细胞的DNA损伤。随后，CCK-8检测显示敲低circTFDP2抑制PCa细胞的增殖能力，反之则反。这些数据表明circTFDP2通过PARP1促进了PCa的进展。
 

图6. circTFDP2通过PARP1调节前列腺癌细胞的DNA损伤

 

七、 外泌体递送的circTFDP2促进前列腺癌进展

新兴的研究表明，癌细胞分泌的外泌体在调节细胞内通讯中起着至关重要的作用，从而参与各种生物学过程。从PCa细胞系的细胞培养基中收集外泌体并进行特征分析。qPT-PCR检测显示，细胞培养基中的外泌体比细胞质中的外泌体含有更多的circTFDP2。并且，circTFDP2在过表达的PCa细胞培养液中的外泌体中含量更高。为了探索外泌体递送的circTFDP2在PCa细胞进展中的作用，作者进行了CCK-8和transwell检测。结果表明，来自circTFDP2过表达细胞的外泌体增强了PCa细胞的增殖和转移。体内异种移植瘤模型结果和体外细胞结果一致。综上所述，外泌体递送的circTFDP2促进了前列腺癌的进展。
 

图7. 外泌体递送的circTFDP2促进前列腺癌进展

 

原文链接

https://doi.org/10.1002/ctm2.1156

参考文献

[1] Vlachaki A, Baltogiannis D, Batistatou A, et al. Screening for prostate cancer: moving forward in the molecular era. J BUON.2018;23:1242-1248.

[2] Singh S, Shyamal S, Panda AC. Detecting RNA–RNA interactome. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2022;13:e1715.

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9263 0 环状RNA联合m6A修饰和泛素化机制为中风患者带来福音 //www.xjpih.com/?p=9205 //www.xjpih.com/?p=9205#respond Fri, 10 Feb 2023 06:35:23 +0000 //www.xjpih.com/?p=9205
缺血性中风（Ischemic Stroke）作为一种常见的脑血管疾病，是我国成年人致残的首要原因。到目前为止，还缺乏促进中风康复和改善长期预后的治疗药物。中风后，缺血边缘区的血管修复可以通过改善血液供应、重构血管周围微环境、促进神经发生及突出形成等多方面促进神经功能恢复，被广泛认为是改善缺血性中风预后的关键修复措施。故研究中风后的血管修复的机制及治疗策略是一个迫切的研究领域，可以使大量患者受益。

环状RNA (circRNAs)是一种内源性非编码RNA分子，具有反向拼接和共价闭合连续环形成的圆形结构。越来越多的证据表明，细胞外囊泡(EV)穿过血脑屏障(BBB)并调控相关基因表达。而有研究发现，circRNA已被证明可以通过增强神经可塑性、抑制神经胶质反应性和外周免疫细胞浸润来改善中风后的运动功能恢复[1]。然而，circRNA是否促进缺血性中风后血管修复及其下游机制尚不清楚。

2023年1月，东南大学医学院姚红红教授课题组在Nature子刊Nature Communications（IF=17.694） 发表文章FTO-dependent m6A modification of Plpp3 in circSCMH1-regulated vascular repair and functional recovery following stroke。作者发现EV-circSCMH1能够有效促进缺血性中风模型小鼠与恒河猕猴脑血管修复，并且显著降低中风模型小鼠脑部N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰。机制上，circSCMH1促进脑血管内皮细胞FTO发生泛素化修饰，增加FTO向核内转移，导致血管发育相关基因-脂质磷酸磷酸酶3（lipid phosphate phosphatase 3，Plpp3）的m6A修饰降低，从而抑制了YTHDF2对Plpp3 mRNA的降解，导致Plpp3 mRNA与其编码蛋白LPP3在内皮细胞中的水平增加，促进血管修复。本研究从血管修复层面扩展了circSCMH1促进缺血性中风脑修复的机制，为治疗缺血性中风的新药研发提供了新思路和新靶点。

 

1、circSCHM1改善缺血性中风恢复期的血管修复

circSCMH1已被报道在中风后可显著增强神经元可塑性和功能恢复。作者为了研究circSCMH1在缺血性中风时血管修复中的潜在参与，通过EVs将circSCMH1传递到血栓形成(PT)的恒河猕猴的大脑。结果显示，circSCMH1可显著增加血管面积、长度及分支数量，增加BrdU阳性细胞以及与血管修复相关的内皮和周围细胞；小鼠模型结果与之一致。总之各项指标均表明，EV-circSCMH1可增加PT模型小鼠梗死周围区域circSCMH1水平，并促进血管修复。而针对于中风模型的血脑屏障完整性的重建，circSCMH1也有着积极的影响。

图1. CircSCHM1改善缺血性中风恢复期的血管修复

2、m6A修饰在中风患者和PT小鼠增加

m6A甲基化参与血管修复已被很多人报道[2]。作者收集了中风患者和非中风的体感觉皮层组织，发现中风患者组织中m6A甲基化水平显著升高，circSCMH1水平较低。作者检测了m6A相关甲基化酶和去甲基化酶的表达，包括METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5，结果发现中风患者组织中FTO水平明显降低，其余基因无明显差异；同样，在小鼠模型上的验证结果与之一致。

图2. m6A修饰在中风患者和PT小鼠增加

 

3、circSCMH1与FTO结合可减少m6 A修饰

前两部分结果指向：

（1）circSCMH1增强中风后血管修复；

（2）在中风和非中风患者中，circSCMH1与m6A水平之间存在负相关。接下来，作者解析了circSCMH1对中风后m6A甲基化影响的机制。EV-circSCMH1作用小鼠大脑后，PT模型诱导后梗死周围区域总RNA的m6A水平显著降低，而敲低circSCMH1的结果与之相反。

 

作者研究了circSCMH1对FTO表达的影响。然而，WB结果显示在中风模型中，EV-circSCMH1组和EV-Vector组的FTO水平无显著差异。这提示，circSCMH1可减弱m6A水平，但不影响中风后FTO水平。

先前的研究表明，FTO在细胞核和细胞质中表现出不同的底物偏好，m6A更可能是细胞核中初级聚腺苷酸RNA中的FTO底物29。因此，作者将眼光放到circSCMH1是否影响FTO转位到细胞核。我们首先研究了circSCMH1和FTO之间的相互作用。

通过RNA结合免疫沉淀试验，与阴性对照circHECW2和GAPDH相比，circSCMH1，而不是SCMH1，在ECs中显示出与FTO更强的亲和力。circSCMH1 pulldown实验显示，circSCMH1比circCon富集更多的FTO。作者进一步利用catRAPID算法预测出FTO中的三个区域与circSCMH1具有较高的互作能力，并设计突变和野生型载体进行了验证。综上提示，ECs中circSCMH1和FTO之间存在互作，并减少了m6 A修饰。

图3. circSCMH1与FTO结合可减少m6 A修饰

 

4、circSCMH1通过泛素化增加了FTO进入细胞核的易位

由于circSCMH1不影响PT小鼠FTO的水平，促使作者进一步检查FTO的核质再分配。结果发现，EV-circSCMH1给药后，PT小鼠FTO水平在细胞质中降低，而在细胞核中增加。这一发现在原发性小鼠大脑微血管ECs和bEnd.3细胞中得到证实。

有研究报道，泛素化可促进FTO从细胞质转移到细胞核，作者接下来研究了circSCMH1对FTO泛素化的潜在影响。circSCMH1过表达显著增加了赖氨酸63（Ub-K63）连接的泛素化水平。UBC13是Ub-K63的E2泛素偶联酶。RNA结合免疫沉淀实验显示，circSCMH1在bEnd中对UBC13具有更强的亲和力。

由于circRNAs被证明可以作为一个支架来增强泛素酶与其靶基因的结合[32]，接下来作者研究circSCMH1是否可以增强FTO与UBC13的结合。免疫共沉淀发现，circSCMH1能够促进FTO和UBC13相互作用。此外，作者发现，UBC13的敲低显著减弱了circSCMH1增强的FTO向细胞核的易位，为此作者做了调控模型如图k所示。综上所述，这些发现表明circSCMH1通过UBC13酶增加FTO的Ub-K63，并促进FTO从细胞质运输到细胞核。

图4. circSCMH1通过泛素化增加了FTO进入细胞核的易位

 

5、circSCMH1调控PT小鼠梗死周围皮层Plpp3 mRNA的m6A修饰

circSCMH1已被验证可降低PT中风模型中m6A甲基化水平，作者接下来探索下游甲基化基因。火山分布图显示，PT模型诱导后，m6A水平在279个转录本峰值区域显著升高，在898个转录本峰值区域显著降低，EV- circSCMH1转录本显著增加213个峰区，减少499个峰区。使用HOMER算法在EV-circSCMH1和EV-Vector治疗后的PT小鼠中鉴定出高度过度代表的共识序列GGACU motif，这表明PT模型m6A修饰的mRNA成功富集。

通过分析m6A峰的密度，我们发现在PT中风诱导后，m6A修饰水平在梗死周围区增加，EV-circSCMH1处理抑制了PT诱导的m6A修饰。PT模型诱导后，14个转录本的m6A峰值显著增加，EV-circSCMH1处理后抑制这14个转录本出现。两组比较中有8个重叠的转录本，这提示circSCMH1影响了PT后血管修复的靶转录本。

m6A通常在3-UTR中富集，作者进一步研究了m6A甲基化的变化是否影响这8种重叠转录本的水平。通过qPCR和WB检测发现，EV-circSCMH1上调血管生成相关基因Plpp3的表达。进一步分析了Plpp3的m6A修饰水平，结果显示，EV-circSCMH1减弱了Plpp3的m6 A修饰水平，而敲低FTO则可逆转这一结果。这表明m6A修饰介导了circSCMH1增强了Plpp3 mRNA的稳定性。

图5. m6A修饰介导了circSCMH1增强了Plpp3 mRNA的稳定性

 

6、FTO过表达促进PT小鼠血管及运动功能的恢复

FTO位于circSCMH1的下游。FTO过表达上调PT中风后Plpp3/LPP3的表达及其m6A甲基化，增加血管长度和分支数，增加BrdU+细胞数，脚部故障减少。这表明，在PT中风后，FTO会促进血管和运动功能的恢复。后续作者又使用了AAV载体构建，结果与此一致，脑中风后FTO的特异性表达有助于血管和运动功能的修复。

图6. FTO过表达促进PT小鼠血管修复

小结

综上所述：作者在恒河猴和小鼠上构建中风模型，发现circSCMH1显著促进中风后的血管修复。具体机制在于，circSCMH1促进脑血管内皮细胞FTO发生泛素化修饰，增加FTO向核内转移，导致Plpp3的m6A修饰降低，从而抑制了YTHDF2对Plpp3 mRNA的降解，导致Plpp3 mRNA与其编码蛋白LPP3的水平增加，促进血管修复。

EV-circSCMH1在缺血性中风后血管修复中的增强作用

 

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-36008-y

参考文献：

[1] Yang, L. et al. Extracellular vesicle-mediated delivery of circular RNASCMH1 promotes functional recovery in rodent and nonhuman primate ischemic stroke models. Circulation 142, 556–574 (2020).

[2] Yao, M. D. et al. Role of METTL3-dependent N(6)-methyladenosine mRNA modification in the promotion of angiogenesis. Mol. Ther.28,2191–2202 (2020).

转载请联系邮箱授权：circRNA@163.com

]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9205 0 Advanced Science | 外泌体circRNA可编码新型蛋白质诱导结直肠癌细胞自噬并产生奥沙利铂耐药性 //www.xjpih.com/?p=9188 //www.xjpih.com/?p=9188#respond Thu, 09 Feb 2023 06:43:36 +0000 //www.xjpih.com/?p=9188
CRC（结直肠癌）作为最常见的恶性肿瘤之一，是癌症导致死亡的第二大因素[1]。虽然临床上-针对CRC患者治疗的方案不断更新迭代，但是CRC患者的总体生存率仍旧很低。L-OHP (奥沙利铂)是一种抑制基因转录和DNA合成的第三代铂化合物，常用于CRC患者手术切除后的化疗方案中。然而，癌细胞最终形成的化学作用可通过多种机制阻碍L-OHP的有效性，包括药物吸收减少和药物失活等。因此，必须明确CRC细胞对L-OHP产生耐药性的精确分子机制，识别有效的生物标记物来分析L-OHP反应，并开发靶向治疗以减少耐药性。

越来越多的研究表示，外泌体中的非编码RNA和蛋白对参与肿瘤侵袭、增殖、免疫逃逸和耐药的靶细胞起作用，尤其是circRNA（环状RNA）。最近的一些研究已经报道了circRNA实际上可以编码蛋白质。并且外泌体富集的circRNA在CRC化疗耐药中的功能和潜在机制备受关注，并需要进一步研究。

近期，广东省人民医院胃肠外科主治医师李勇在Advanced Science上发表文章：A Novel Protein Encoded by Exosomal CircATG4B Induces Oxaliplatin Resistance in Colorectal Cancer by Promoting Autophagy。文章表示：L-OHP虽常用于结直肠癌手术切除后的化疗方案，但是其耐药性的出现会影响CRC患者的疗效。而circATG4B是L-OHP耐药发生的关键。机制在于，circATG4B可编码一种新的蛋白质（circATG4B-222aa）与TMED10互作，阻止TMED10与ATG4B结合，从而导致自噬增加，继而诱导L-OHP耐药。研究揭示了外泌体circATG4B参与了CRC细胞化疗敏感性的降低，为潜在的治疗CRCL-OHP 耐药靶点提供了新的理论基础。

1.L-OHP耐药CRC中ATG4B相关circRNA的分析

ATG4B在各种癌症中的自噬诱导功能，已被报道与化疗耐药有关[2]。因此，作者在circBase找到15个ATG4B，并从中发现circATG4B(hsa_circ_0007159)在L-OHP 耐药患者的CRC组织以及耐药CRC细胞系中明显上调。背靠背引物验证/R酶处理/FISH验证circATG4B成环/稳定/定位胞质。这些结果表明circATG4B稳定存在，并与CRC患者的L-OHP 反应密切相关。

图1. circATG4B的特性

 

2.来自外泌体的circATG4B诱导CRC细胞耐药性

以前的研究已经证明，circRNA可以包装成外泌体，并可以进行细胞间转移。因此，我们假设从L-OHP 耐药的CRC细胞分离出的外泌体circATG4B可转移到L-OHP 敏感细胞，导致细胞产生耐药性。为了验证这一假设，从L-OHP 耐药CRC细胞上清液中分离出的外泌体，电镜/NTA/WB观察其双层膜的结构/前体大小分布/外泌体标记物的表达，且circATG4B在外泌体中含量丰富；然后发现，该外泌体可侵染正常CRC细胞。此外，体外细胞实验+体内表示，外泌体circATG4B降低了CRC患者对L-OHP 的敏感性；而敲低circATG4B则有相反的结果。

图2.  外泌体的circATG4B诱导CRC细胞耐药性

 

3.外泌体circATG4B增强L-OHP 耐药过程中的自噬活性

根据以往的研究，自噬在药物耐药过程中起着重要作用。作者发现自噬诱导剂——雷帕霉素可诱导CRC细胞耐药，自噬抑制剂——3-甲基腺嘌呤增加CRC细胞耐药；L-OHP 会增加CRC细胞自噬水平，进而诱导CRC细胞耐药。而同时外泌体circATG4B可诱导CRC细胞L-OHP 耐药，作者推测自噬介导了该作用。过表达circATG4B增强CRC细胞耐药性，然而，3-甲基腺嘌呤治疗逆转了这一作用，表明circATG4B可以通过自噬诱导耐药。此外，透射电镜(TEM)分析显示，exo-si-NC预处理后自噬体数量增加，而exo-si-circATG4B预处理后自噬体数量显著减少(图3G)。进一步证实了外泌体circATG4B通过调节自噬诱导CRCL-OHP 耐药。

图3. 外泌体circATG4B促进细胞自噬

 

4.circATG4B编码一种新的蛋白-circATG4B-222aa诱导细胞L-OHP耐药

MicroRNA (miRNA)海绵作用是circRNA最常见的功能。然而，RIP结果显示circATG4B与AGO2无关，这表明circATG4B可能通过不同的机制发挥其功能。越来越多的证据表明，一些circRNA能够编码新的蛋白质。通过查阅circRNA Db发现，circATG4B有一个669nt的ORF，有可能编码222个氨基酸的蛋白质，并且其中有一段包含33个氨基酸的新序列。作者在ORF中发现534nt-672nt处有一个IRES，并用双荧光素酶法验证了circATG4B中IRES具有活性。随后，作者构造了四个不同的载体(阴性空载对照/带Flag标签载体/突变起始密码子+Flag标签阴性载体对照/线性阳性载体对照)，又研发了一种新的抗体（特异识别circATG4B-222aa），用qPCR和WB证实circATG4B-222aa能够被翻译出来。最后，通过SDS-PAGE分离转染了circATG4B细胞的总蛋白，然后将大小接近24kd的蛋白条带切除并提交质谱分析，发现了circATG4B的剪接位点处所形成的独特肽序列(IAELDPSIAVIGGGHKG)，表明circATG4B可以编码一种新的蛋白质。此外，在接受L-OHP 治疗的CRC患者中，circATG4B-222aa表达与不良预后呈正相关，这提示circATG4B-222aa可能是L-OHP 耐药细胞的预后标志物。

图4. circATG4B编码CircATG4B-222aa

 

作者通过将上述4种载体体外转染到CRC细胞中发现，仅转染circATG4B或circATG4B-222aa过表达载体后，自噬增加，CRC细胞耐药性增加；另外，作者又在体内小鼠中做皮下注射稳转四种载体细胞，结果同体外实验相同。这些结果表明，能够编码circATG4B-222aa的载体才可增加自噬水平，诱导细胞L-OHP 耐药。

图5.完整的circATG4B才可增加自噬水平，诱导细胞L-OHP耐药

 

5.circATG4B-222aa与TMED10蛋白互作，释放ATG4B

为了进一步探索circATG4B-222aa在自噬中的潜在机制。作者CO-IP/MS/IF检测circATG4B-222aa互作蛋白发现并验证了TMED10，并且二者定位于胞质。为了探索TMED10与circATG4B-222aa相互作用的区域，作者构建了一系列GFP标记的TMED10删除突变体。并通过Co-IP/WB实验验证，TMED10的TD和CD都是TMED10与circATG4B-222aa相互作用的必要条件。

通过与标记了circATG4B-222aa的截断突变体相互Co-IP分析，我们还确定了circATG4B-222aa与TMED10相互作用相关的区域。circATG4B-222aa (aa 1-111)和circATG4B-222aa (aa 112-222)都可以被TMED10拉下，表明无论是整段circATG4B-222aa还是前半段和后半段都可以与TMED10相互作用。但是在进一步的研究中，结果显示，只有全长的circATG4B-222aa可增加自噬过程。

由于circATG4B-222aa除了独特的氨基酸外，其大部分氨基酸序列与线性基因ATG4B相同，作者推测circATG4B-222aa可能通过结合TMED10，释放ATG4B。随后CO-IP结果发现，circATG4B-222aa过表达削弱了TMED10和ATG4B之间的相互作用，这表明circATG4B-222aa可结合TMED10，释放ATG4B。综上所述，这些发现表明circATG4B-222aa可能作为TMED10的诱饵，从而释放TMED10抑制的ATG4B。

图6.circATG4B-222aa与TMED10蛋白互作，释放ATG4B

 

6.circATG4B-222aa逆转TMED10诱导的L-OHP耐药CRC细胞的化疗敏感性

随后，作者评估了circATG4B-222aa和TMED10之间的相互作用在L-OHP 耐药细胞中的作用。体外实验发现，circATG4B-222aa可逆转了TMED10在耐药CRC细胞中诱导的凋亡和化疗敏感性的增加；体内实验发现，在植入过表达TMED10的细胞组中，肿瘤生长和体重均显著下降，而过表达circATG4B-222aa则逆转了这种抑瘤作用。总之，这些结果表明circATG4B-222aa可以拮抗TMED10作用，诱导细胞L-OHP耐药。

图7.circATG4B-222aa拮抗TMED10作用，诱导细胞L-OHP耐药

 

原文链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202204513

参考文献：

H. Sung, J. Ferlay, R. L. Siegel, M. Laversanne, I. Soerjomataram, A.Jemal, F. Bray, CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209.

A. Agrotis, R. Ketteler, Cells 2020, 9, 53.

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9188 0 环状RNA发挥分子海绵作用，可为青少年肉骨瘤患者提供诊断和治疗的靶点 //www.xjpih.com/?p=9107 //www.xjpih.com/?p=9107#respond Wed, 04 Jan 2023 08:55:54 +0000 //www.xjpih.com/?p=9107
骨肉瘤（OS）是常见的恶性骨肿瘤，特别是在儿童和青少年中，其特点是具有侵袭性以及预后不佳，约20%的患者在第一次就诊OS时由于恶性生物学行为而出现肺转移。目前，OS发病和转移机制尚不清晰，寻找新的转移因子并确定其在骨肉瘤中的潜在机制是很有必要的。

环状RNA（circRNAs）是一种新型的调控RNA，具有高度进化保守性和稳定性。circRNA可发挥miRNA海绵/RBP互作/翻译/转录调控等作用，有望成为各种恶性肿瘤的潜在诊断生物标志物和治疗靶点。针对于OS，目前已有报道，circTADA2A可通过发挥miR-203a-3p海绵作用来增加恶性OS行为，但是circRNAs在OS中的调控功能和潜在机制研究仍然任重而道远[1]。

2022年8月29日，浙江大学医学院附属第一医院骨科王勇医师在Experimental and Molecular Medicine发表文章Circular RNA ROCK1, a novel circRNA, suppresses osteosarcoma proliferation and migration via altering the miR-532-5p/PTEN axis。结果显示：OS中circROCK1-E3/E4的表达受到QKI（RNA结合蛋白）调节，并起到抑制肿瘤生长的作用。机制上，过表达circROCK1-E3/E4可发挥miR-532-5p海绵作用上调PTEN（一种抑癌基因）来抑制OS细胞增殖和迁移。并且裸鼠模型中，过表达circROCK1-E3/E4抑制肿瘤生长和肺转移。本研究证明了circROCK1-E3/E4在OS进展中的功能和分子机制，诸多发现可作为OS分子治疗的新靶点。

一、circROCK1-E3/E4可作为OS诊断的生物标志物

前人已经证实ROCK1基因在OS进展中起到关键作用[2]。因circRNA具有比线性RNA更稳定的特性，作者将目光聚焦到可能来自ROCK1基因的潜在circRNA，经过circBase筛选，又在OS组织和旁组织中进行进一步检测，circROCK1-E3/E4（hsa_circ_0108024）脱颖而出。通过背靠背引物设计/poly尾巴检测/ RNase R和放线菌素D/FISH定位检测到circROCK1-E3/E4的成环/特点/稳定性/细胞定位。在OS细胞和组织水平上，circROCK1-E3/E4显著下调，根据此结果附加ROC曲线分析信息，提示circROCK1-E3/E4可能是诊断OS的生物标志物。

图1.circROCK1-E3/E4的特性

二、QKI调控CircROCK1-E3/E4生成

QKI是一种众所周知的RNA结合蛋白，可促进circRNA形成。那么，QKI是否调控了circROCK1-E3/E4的生物发生呢？作者敲除QKI发现抑制了circROCK1-E3/ E4表达，但没有抑制ROCK1 mRNA表达。RIP结果显示，与β-actin相比，circROCK1-E3/ E4内含子2和内含子4的部分序列大量富集于QKI蛋白中。综上提示，QKI与circROCK1-E3/ E4生成密切相关。

图2. circROCK1-E3/E4表达受到QKI的调控

 

三、circROCK1-E3/E4调控OS细胞功能

作者设计过表达和敲低circROCK1-E3/ E4，并在HOS和U2OS细胞上加以验证后发现，下调circROCK1-E3/ E4可促进OS细胞的增殖，反之则抑制增殖；EdU染色结果与此一致。此外，下调circROCK1-E3/E4促进OS细胞迁移，过表达则抑制迁移。提示circROCK1-E3/ E4对OS细胞的反向作用。

图3. circROCK1-E3/E4反向作用于OS细胞功能

四、circROCK1-E3/E4机制探索-分子海绵功能

作者用RIP检测circROCK1-E3/E4处理的细胞，使用AGO2作为阳性对照和cANRIL作为阴性对照，发现存在大量的circROCK1-E3/E4富集在AGO2组，提示circROCK1-E3/E4可能发挥分子海绵的作用。随后，又经过circBank、miRDB和TargetScan预测可能与circROCK1-E3/E4相互作用的潜在miRNAs，miR-532-5p被选中并进行进一步研究。通过定量分析发现，miR-532-5p在OS存在高表达。随后FISH检测circROCK1-E3/E4与miR-532-5p共定位于细胞质中；双荧光素酶证实了二者之间存在结合。不过奇怪的是，Spearman相关分析显示，circROCK1-E3/E4表达量与miR-532-5p呈负相关；但是敲低circROCK1-E3/E4对miR-532-5p无影响，并且miR-532-5p也不影响circROCK1-E3-E4的表达。

图4. circROCK1-E3/E4海绵机制

 

五、海绵机制下游探索-靶基因效应

PTEN作为一种众所周知的肿瘤抑制因子，广泛参与了ncrna介导的多种恶性肿瘤的癌症进展。作者发现，miR-532-5p的上调和下调会反向调控PTEN的表达。在细胞功能上，miR-532-5p的上调促进了细胞增殖。但是协同上调PTEN，促进作用被逆转，反之则结果相反；并且双荧光素酶实验证实了miR-532-5p通过结合PTEN 3‘UTR靶向PTEN（图5i）。这提示，miR-532-5p在OS细胞中通过靶向PTEN作用来调控细胞的增殖和迁移。

图5. miR-532-5p靶向PTEN调控OS细胞增殖和迁移

 

作者证实circROCK1-E3/E4在蛋白水平上正向调控PTEN的表达，而miR-532-5p加入则可逆转这一作用。在细胞功能上，miR-532-5p也能够逆转circROCK1-E3/E4对细胞增殖/迁移/侵袭的作用。综上所述，circROCK1-E3/E4至少部分通过调控miR-532-5p/PTEN轴促进细胞增殖和迁移/侵袭。

 

图6.circROCK1-E3/E4通过调控miR-532-5p/PTEN轴介导OS细胞增殖和迁移

 

六、原位异种移植小鼠模型验证

作者引入了原位异种移植小鼠模型发现，过表达circROCK1-E3/E4显著抑制了OS肿瘤的生长，并且PTEN mRNA表达上调，而miR-532-5p的表达变化并不显著。进一步的WB和IHC实验表明，过表达circROCK1-E3/E4促进PTEN蛋白的表达。小鼠OS的肺转移模型结果显示，过表达circROCK1-E3/ E4虽然不能够改变miR-532-5p表达，但是能够抑制肺内转移性淋巴结的形成。至此，体外实验和体内实验均证实，circROCK1-E3/E4靶向miR-532-5p/PTEN轴可调控OS的生成。

图7.circROCK1-E3/E4在体内抑制OS生成circROCK1-E3/E4在

总结

作者首次在研究中发现，circROCK1/E3E4受QKI调控，可靶向OS中的miR-532-5p/PTEN轴来调控OS细胞增殖和迁移。本研究结果可为进一步探索OS中circRNA的功能、诊断和治疗方案奠定基础。

circROCK1/E3E4在OS中潜在的分子机制

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s12276-022-00806-z

参考文献：

[1] Wu, Y. et al. Circular RNA circTADA2A promotes osteosarcoma progression and metastasis by sponging miR-203a-3p and regulating CREB3 expression. Mol. Cancer 18, 73 (2019).

[2] Wang, Y., Zhao, W. & Fu, Q. miR-335 suppresses migration and invasion by targeting ROCK1 in osteosarcoma cells. Mol. Cell. Biochem. 384, 105–111 (2013).

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9107 0 环状RNA发挥分子海绵作用可作为“帕金森”病的诊断标志物 //www.xjpih.com/?p=9080 //www.xjpih.com/?p=9080#respond Mon, 26 Dec 2022 05:51:26 +0000 //www.xjpih.com/?p=9080
帕金森病(PD)是继阿尔茨海默病(AD)之后第二常见的神经退行性疾病。PD的发病率主要集中在65岁以上的中老年人，且发病率随年龄增长[1]。帕金森病的主要病理是促进黑质多巴胺能神经元变性和死亡。随着神经元的死亡，体内多巴胺(DA)水平逐渐降低。当纹状体(STR)中的DA水平降低80%时，可能会伴随震颤、强直、运动衰竭和平衡障碍等临床症状。并且，一旦个体出现症状，在黑质致密部(SNpc)多巴胺能神经元的损失接近70%。因此，准确的诊断有利于PD的预防和治疗。环状RNA (circRNAs)可通过反向剪接，形成共价闭合环状结构。它们在神经系统中大量表达，已成为神经系统疾病的潜在标志物和治疗靶点[2]。外泌体是细胞来源的囊泡，直径30~100nm。研究已经证实，外泌体存在于许多体液中，包括血液、尿液和唾液。circRNA利用外泌体作为转运体，可以穿过血脑屏障进入血液，稳定存在于外周血中。因此，从脑和神经组织病变中释放的circRNAs可以在外周血中检测到，有可能作为一种新的生物标志物来辅助帕金森病的诊断。因此，进一步探索circRNA参与PD的分子机制，有助于更好地理解PD的发病机制和开发治疗靶点。

2022年10月，北京大学医学部基础医学院张卫光教授在Redox Biology发表文章CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson’s disease。作者通过构建PD小鼠模型，随后测序、筛选到circSV2b下调。然后，采用体内功能实验探讨circSV2b在PD中的作用，在体外进行CUT&Tag以证实circSV2b结合miR-5107-5p进而释放靶基因Foxk1，然后正调节Akt1转录。机制分析表明，在PD模型中，circSV2b过表达通过ceRNA-Akt1轴抵抗氧化应激损伤。总而言之，miR-5107-5p-Oxk1-Akt1轴可能是PD治疗中circSV2b过度表达的关键靶点。因此，circSV2b可作为诊断和治疗PD的新生物标志物。
 

01、circSV2b 在MPTP诱导的PD小鼠中下调

作者使用MPTP建立PD小鼠模型。结果显示，PD小鼠DA及其代谢产物(DOPAC和HVA)的水平降低，运动平衡受损，损伤了多巴胺能神经元。随后，作者使用CIRI2、CIRCexplorer2和DEBKS软件分析PD小鼠SNpc和STR组织的RNA-seq数据，又使用qRT-PCR验证，最终circSV2b作为下调代表，被选中作为研究对象。作者通过背靠背引物验证circSV2b成环，RNase R验证circSV2b的稳定性。

图1. circSV2b 在MPTP诱导的PD小鼠中下调

 

02、circSV2b的过表达改善了PD小鼠的症状

作者采用腺相关病毒技术评估circSV2b过表达对PD小鼠的保护作用（AAV注射组、行为实验组和MPTP注射组）。qRT PCR结果发现，注射AAV导致circSV2b过表达，缓解了小鼠运动平衡障碍，恢复了DA水平等有益现象。这些结果表明，过表达circSV2b可恢复DA合成，提高MPTP诱导的PD小鼠运动机能。 

图2.circSV2b的过表达改善了PD小鼠的症状

 

03、CircSV2b发挥ceRNA机制

CircRNAs可发挥miRNAs的分子海绵、翻译和转录调控等多重作用。miRNA的分子海绵是定位于细胞质的circRNA发挥作用的主要途径。FISH实验和核质分离后qRT-PCR均表示，circSV2b定位于细胞质中。若circRNA发挥分子海绵作用，则circRNA必须与miRNA和AGO2蛋白形成复合体。FISH共定位结果显示circSV2b和AGO2共定位于细胞质。circRNA与miRNA结合使用miRanda、TargetScan和RNAhybrid三重筛选，鉴定出13种miRNA。miRTarBase工具用于预测miRNA靶基因；只有3个候选miRNAs具有下游靶基因。作者比较了MPTP处理后SNpc组织中候选miRNA的水平。结果显示，与其他候选miRNAs相比，miR-5107-5p的升高更为显著。进一步使用抗AGO2抗体和circSV2b探针分别进行RIP和RNA pulldown实验证明，circSV2b具有miRNAs分子海绵的功能。由于已有研究证实Foxk1受lncRNA通过ceRNA机制调控，因此在miR-5017-5p的预测靶基因中，Foxk1被选为下游分子。circSV2b、miR-5107-5p和AGO2在细胞质中共定位。而miR-5107-5p和Foxk1也共定位于细胞质。由于miRNA与mRNA的结合也依赖于AGO2，我们进一步使用Foxk1探针进行了RNA pulldown实验，发现Foxk1与AGO2结合。为了证实生物信息学预测分析，作者使用双荧光素酶报告实验验证，miR-5107-5p与circSV2b之间存在相互作用，miR-5107-5p与mRNA Foxk1之间存在相互作用。上述结果表明circSV2b与miR-5107-5p相互作用，miR-5107-5p与mRNA Foxk1相互作用。

图3.CircSV2b发挥ceRNA机制

 

04、Foxk1是Akt1的转录因子

由于氧化应激在PD发病机制中的重要作用，作者利用CUT和Tag-seq筛选Foxk1下游与氧化应激相关的靶基因。本采用双重复方法，对样本的数据进行质量评价和质量控制，发现有8013个重叠峰。作者对与峰值相关的基因(转录起始位点(TTS)最接近峰值的基因)进行了基因注释，并对峰值相关基因进行了基因本体(GO)注释和富集分析。对于GO，两个样品均富集氧化应激反应。在本GO项中，选取Akt1的峰值检测结果进行可视化，样品中对应的峰与Akt1的TTS非常接近。作者将目标峰序列与Foxk1 motif进行了比较，发现它们是一致。综上可知，Foxk1是Akt1的转录因子。

图4.Foxk1是Akt1的转录因子

05、CircSV2b调控miR-5107-5p的表达，miR-5107-5p影响Foxk1的表达，Foxk1影响Akt1的表达

为了进一步探索ceRNA-Akt1的调控作用，作者设计过表达circSV2b质粒在N2A细胞进行验证。结果发现circSV2b过表达后，miR-5107-5p表达下调，Foxk1表达上调。WB分析显示，circSV2b过表达后，Foxk1和Akt1均上调。相反，作者设计了3个circSV2b敲低质粒，结果与过表达相反。此外，作者使用miR-5107-5p mimic转染后，Foxk1和Akt1 mRNA和蛋白表达下调。转染miR-5107-5p inhibitor后，Foxk1和Akt1 mRNA和蛋白表达上调。作者又设计了Foxk1过表达质粒，WB结果显示过表达Foxk1后，Akt1表达上调，而干扰Foxk1则相反。

图5.circSV2b与miR-5107-5p/Foxk1/Akt1轴互作

06、过表达circSV2b通过ceRNA-Akt1途径抵抗PD中的氧化应激损伤

为了探索circSV2b过表达导致PD耐药的机制，作者在注射AAV 21天后使用MPTP创建了PD小鼠模型。评估ceRNA-Akt1通路中各分子和氧化应激分子的表达变化。结果表明，circSV2b过表达逆转了MPTP引起的miR-5107-5p的升高，缓解了Foxk1和Akt mRNA和蛋白表达的降低。并且circSV2b过表达降低了MPTP引起的氧化产物MDA的升高，并增强了抗氧化酶(SOD和GSH-PX)的活性。

图6.过表达circSV2b通过ceRNA-Akt1途径抵抗PD中的氧化应激损伤

小结

作者表示，在MPTP条件下，circSV2b过表达可以防止SNpc中多巴胺能神经元的神经退行性变和氧化应激损伤。circSV2b过表达在PD中的神经保护作用可能主要由miR-5107-5p-Foxk1-cAkt1轴介导——这一过程从数据库分析到验证都比较缜密。circSV2b可以通过外泌体转运到外周血，在PD模型的血清外泌体中可以检测到其水平的变化。这提示circSV2b可以作为诊断PD的生物标志物，并且，作者使用了腺相关病毒技术，解析了过表达circSV2b对模型小鼠神经良好的保护作用使其成为治疗PD的一个有前途的靶点。

图7.circSV2b在MPTP诱导的PD中的机制

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s12276-022-00806-z

参考文献：

[1] M.T. Hayes, Parkinson’s disease and parkinsonism, Am. J. Med. 132 (7) (2019)802–807, https://doi.org/10.1016/j.amjmed.2019.03.001.

[2] X. You, I. Vlatkovic, A. Babic, et al., Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulated by development and plasticity, Nat. Neurosci. 18 (4) (2015)603–610, https://doi.org/10.1038/nn.3975.

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2019年爆发的新型冠状病毒病（COVID-19）是一种由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的传染性急性呼吸系统疾病[1]。截至2022年中旬，全球报告的累计病例数已超过5亿，累计死亡人数超过600万例。COVID-19的迅速传播威胁了世界各地人们的生命和健康[2]。在此背景下，我们迫切需要预防性疫苗和治疗性药物，以保护个人免受COVID-19感染。

人类对于扼制COVID-19已经开展了行动。目前，已有几种药物用于COVID-19的临床治疗，如小分子抗体、中和抗体和单克隆抗体等；腺病毒载体疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗和核酸疫苗也在加速研发和实验中。然而，疫苗疗效的稳定和不良反应因人而异。因此，开发安全有效的药物和疫苗来预防、诊断和治疗COVID-19刻不容缓。

环状RNA（circRNAs）是在细胞内丰富、稳定、普遍存在的非编码RNA分子，具有microRNA（miRNA）海绵/RNA结合蛋白/调节转录/翻译为蛋白质的功能，在各种疾病的发病机制中显示出了独特的效果。有研究表明，circRNA是病毒感染和抗病毒免疫应答的关键调控因子，并与COVID-19的病理变化密切相关[3]。在COVID-19感染过程中，circRNA不仅直接影响转录过程，干扰病毒复制，还间接调节病毒-宿主受体结合和免疫应答等生物过程[4]。

2022年10月19日，西南医科大学罗茂研究员在Frontiers in Immunology发表文章Circular RNAs as emerging regulators in COVID-19 pathogenesis and progression。文章综述了circRNA是病毒感染和抗病毒免疫应答的关键调节因子，在COVID-19感染过程中调控SARSCoV-2感染诱导的炎症反应、病毒复制、免疫逃逸和细胞因子的作用和机制；深层次的挖掘circRNA在COVID-19机制研究，为诊断和治疗COVID-19提供研究思路。

 

一、认识SARS-CoV-2与其相关的circRNA

1.SARS-CoV-2的结构及发病机制

冠状病毒（CoV）是冠状病毒科中最大的包膜单链阳性RNA病毒，已分为α、β、γ和δ4个种属。基因序列分析显示，SARS-CoV-2B属于β-冠状病毒系，可介导病毒附着于宿主细胞表面受体，通过与ACE2结合触发内吞机制，进入宿主细胞，此过程依赖TMPRSS2，是冠状病毒感染的第一步。并且，SARS-CoV-2靶点主要在上呼吸道上皮细胞中进行复制，主要靶点是纤毛支气管上皮细胞和II型肺泡细胞。

SARS-CoV-2进入细胞后，借助宿主细胞的内源性转录机制和自身特性在宿主内复制和传播，诱导细胞快速衰变。为什么SARS-CoV-2不能够被快速识别和消灭呢？主要因为SARS-CoV-2可抑制MHCI类通路的激活，而该通路在抗病毒免疫过程中有着关键的作用（如图1）。此外，SARS-CoV-2不仅直接损害肺组织，还触发细胞内环境“风暴”—过度活化细胞因子和免疫细胞，导致弥漫性肺泡损伤，加剧患者呼吸衰竭，甚至可能导致无法控制的系统性炎症反应。

图1.SARS-CoV-2进入细胞的机制和生命周期

 

2.SARS-CoV-2与其相关circRNA

circRNA可以作为多种病毒性疾病的生物标志物和治疗靶点，因为它们的异常水平反应了病理和预后的进展。病毒编码的circRNA可能通过调节病毒和宿主基因的表达，在宿主-病毒的相互作用中发挥重要作用，COVID-19也不例外。CoV编码的circRNA是冠状病毒转录组的重要组成部分。在不同的时间段或不同的组织或细胞中表达不同的circRNA介导着COVID-19发病机制。作者总结了circRNA在COVID-19、SARS和MERS发病机制中的作用（详见原文表1），为进一步了解CoV相关circRNA表达水平的变化及其在发病机制和病毒复制中的作用提供了理论基础。

 

二、潜藏于SARS-COV-2感染后的circRNA机制

1.circRNA的miRNA的海绵作用

cicrRNA作为miRNA海绵发挥ceRNA作用抑制mRNA表达进而调控下游靶基因表达的机制是每一位科研人员做circRNA机制研究必须要考虑的。并且，circRNA的海绵功能已被证实比miRNA和lncRNA转录本更有效。MERS-CoV病毒感染研究发现circRNA发挥miRNA海绵机制；SARS-CoV-1病毒感染细胞中，circRNA/lncRNA/mRNA/miRNA组成的ceRNA网络可调控着病毒的生命周期（图2）。总的来说，这些结果均为circRNA作为抗SARS-CoV-2感染的宿主靶向抗病毒策略提供了新的见解。

图2.circRNA作为miRNA海绵影响病毒复制

 

2.circRNA参与调节SARS-CoV-2感染的免疫反应

细胞因子是由多种细胞合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，参与免疫和炎症等反应，并在病毒感染过程中控制免疫反应和靶细胞拮抗病毒复制方面发挥着至关重要的作用。circRNA在炎症中的潜在作用是在多细胞生物中进化出的一套生物机制，通过激活先天和后天免疫反应来抑制侵入性病原体并化解损伤，介导机体产生适当的细胞因子以消除病原体和引起免疫风暴导致细胞损伤之间取得平衡。图3介绍了circRNA调控的炎症信号通路与免疫风暴和不良预后的关系。在SARS-CoV-2感染过程中，circRNA可发挥多重作用，调控白介素相关因子、表皮生长因子、缺氧诱导因子-1、雷帕霉素靶蛋白和肿瘤坏死因子等表达以及相关信号通路的变化，促进细胞因子紊乱，从而破坏了促炎和抗炎机制之间的平衡，进而导致COVID-19患者的继发性疾病。图3亦揭示了circRNA可能通过影响细胞因子来调节SARS-CoV-2感染中的免疫反应。

图3.SARS-CoV-2感染中的circRNA在炎症反应中的潜在机制

3.circRNA与SARS-CoV-2介导的免疫逃避

先天免疫反应可以有效阻止病毒入侵宿主。然而，有些病毒已经进化出了躲避宿主免疫反应的能力。如图4所示，在SARS-CoV-2增殖过程中，病毒核酸中间体和释放的基因组RNA通过一系列反应增强病毒耐药性。但是，部分研究发现，在SARS-CoV-1侵染过程中，有些circRNA发挥分子海绵作用降低ISG介导的抗病毒效应，而有些参与病毒免疫逃避和复制。已有研究报道，基因融合与多种疾病的发生发展密切相关，融合基因可能成为潜在的药物靶点。因此，SARS-CoV-2转录组中的非典型融合亦有可能为病毒突变的产生以及病毒在感染组织中的存活和免疫逃避提供条件。

图4.circRNA调节SARS-CoV-2的免疫逃避

 

三、COVID-19新疗法-circRNA的应用

1.circRNA作为COVID-19的生物标志物

circRNA抗RNase R降解，半衰期较长，表达模式受病毒感染影响，在COVID-19患者的循环系统中含量丰富并具有独特的功能。外泌体可反映细胞的病理状态，它们可以用作各种疾病的诊断标记。而最近的研究表明外泌体circRNA可能是COVID-19复发的一个关键因素。因此，外泌体相关环状RNA的鉴定和分离可能有助于COVID-19的诊断。

 

2.circRNA作为COVID-19的潜在治疗靶点

自COVID-19爆发以来，ACE2基因被认为是SARS-CoV-2进入宿主细胞的受体。因此，调控ACE2的转录和产生是防止病毒与宿主细胞结合以预防COVID-19的一种新途径。先前的研究表明，SRY基因可抑制ACE2启动子活性，而SRY转录本主要以circRNA的形式存在（占比90%以上），提示circRNA可能通过调节SRY相关基因来影响ACE2的转录过程，从而介导SARS-CoV-2感染宿主。这也可能是COVID-19的男性的发病率显著高于女性的原因。此外，有研究表明，AXL是SARS-CoV-2侵袭宿主细胞的新型候选受体。机制在于，AXL可特异与SARS-CoV-2基因组的n端结构域互作，无需ACE2协助进入宿主细胞。这提示AXL可作为未来治疗COVID-19的潜在靶点。而值得注意的是，有研究发现circRNA可调节AXL信号转导通路靶向miRNA，可能参与SARS-CoV-2的侵袭。综上所述，circRNA可能通过调节SARS-CoV-2与相关宿主受体的结合，成为治疗COVID-19的靶点。

病毒感染引起的免疫可以保护细胞功能，抵抗病毒入侵，清除病毒，清除感染。然而，过度激活免疫反应可能会对宿主造成严重的损伤。COVID-19患者中SARS-CoV-2可诱发免疫风暴，从而对组织和器官造成广泛损伤。而circRNA-miRNA-mRNA调控网络有助于调控免疫相关因子及其涉及的信号通路（NF-kB/MAPK/mTOR）降低免疫风暴，可能成为治疗COVID-19的新途径。

 

种种迹象表明，相较于易降解mRNA，具有高稳定性和RNase抗性的circRNA在与新冠病毒和癌症相关的研究必将成为众多高校、科研单位、核酸药物公司的热点和焦点。自北京大学魏文胜首次报道针对新冠病毒的circRNA疫苗发挥了较mRNA更好的免疫保护作用后，circRNA作为癌症诊断治疗的新兴技术，迅速得到业界的关注，必将开拓千亿蓝海市场。

国外以Orna Therapeutics和Laronde为代表，国内环码生物、圆因生物、吉赛生物和科锐迈德等公司先后布局环形RNA技术平台。目前尚未有基于circRNA的产业级癌症疫苗被开发出来，因此需要进一步探究circRNA疫苗在肿瘤免疫治疗中的适用性。我们期待这一创新技术能够早日进入临床开发阶段，展现它在感染性疾病、自身免疫病、罕见病以及癌症的预防或治疗的潜力。

 

原文链接：

https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.980231

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9044 0 新发现！沈柏用团队解析环状RNA可发挥多个“热点”机制促进胰腺癌进展 //www.xjpih.com/?p=9023 //www.xjpih.com/?p=9023#respond Wed, 23 Nov 2022 07:33:26 +0000 //www.xjpih.com/?p=9023
胰腺癌（PC）是一种具有毁灭性的恶性肿瘤，特点是：诊断延迟、转移、发生率高、预后不良和化疗不敏感[1]。值得注意的是，PC患者的五年生存率低于5%，并且重要特征是缺氧[2]。尽管外科手术和化学疗法一直在发展，PC的预后仍然令人失望。因此，迫切需要确定PC的早期诊断生物标志物、分子机制和功能治疗靶点。

circRNA（环状RNA）是一种通过选择性剪接形成的非编码RNA。circRNA的环状结构使其难以在体内降解，并在肿瘤和血清外泌体中特异性表达。因此，circRNA可被视为肿瘤发生的有效RNA生物标志物。就机制而言，研究表明circRNA可能通过充当ceRNA来海绵miRNA或充当支架来调节肿瘤进展[3]。并且外泌体携带的circRNA可在细胞间通信中发挥重要作用。

上海交通大学医学院瑞金医院胰腺疾病中心普通外科沈柏用教授在Journal of Hematology & Oncology 发表文章：Hypoxia-induced exosomal circPDK1 promotes pancreatic cancer glycolysis via c-myc activation by modulating miR-628-3p/BPTF axis and degrading BIN1。文章指出：circPDK1在PC肿瘤组织和血清外泌体中高度丰富，并与PC不良生存率相关。外泌体circPDK1在体外和体内显著促进PC细胞增殖、迁移和糖酵解。从机制上讲，HIF1A通过激活宿主基因PDK1上调circPDK1，circPDK1通过调节miR-628-3p/BPTF轴和降解BIN1激活c-myc，从而促进PC生成。本文章提出，外泌体circPDK1可能是PC诊断和预后的潜在生物标志物和治疗靶点。

 

01、RNA-seq测序鉴定低氧PC细胞外泌体中的环状RNA

缺氧可增加PC细胞的外泌体分泌。而circRNA在外泌体中大量稳定存在，在癌症中可能是关键调控因子，这已被广泛证实[4]。作者使用RNA-seq测序检测从常氧和低氧PC细胞中纯化的外泌体，共鉴定出78个差异表达的circRNA，用qRT-PCR在癌症和癌旁组织中，分析前5个上调和下调的circRNA，发现circPDK1是PC中上调最多的circRNA。然后，在大量的癌症和癌旁的组织芯片中进行ISH检测，结果显示，circPDK1在肿瘤组织中比在配对的正常组织中更丰富。随后，作者又选取110例配对的术后PC组织和正常组织，采用qRT-PCR方法分析circPDK1的表达。结果显示，circPDK1在PC中显著上调，并与淋巴结转移、晚期病理分期和不良预后呈正相关。

circRNA在血清外泌体中被广泛检测到，并被认为是血清外泌体中潜在的肿瘤标志物。因此，为了探索circPDK1是否可以在血清外泌体中检测到，以及它作为肿瘤标志物的潜力，作者收集了20名PC患者和10名健康个体的血液样本作为对照。结果发现，来自血清外泌体的circPDK1在PC患者中大量表达，而在健康对照组中几乎不存在。综上所述，circPDK1在PC中显著上调，并与PC的不良预后相关，可在血清外泌体中稳定传递和富集。这表示，circPDK1可作为PC的早期诊断的circRNA生物标志物。

图1. RNA-seq测序鉴定低氧PC细胞外泌体中的circPDK1

02、circPDK1特性

circPDK1 (has_circ_0057104)由PDK1的第7-10外显子生成，长度为401 nt，通过Sanger测序和背靠背引物验证鉴定circPDK1的成环效应。RNase R或放线菌素D处理表明，circPDK1在PC细胞中稳定。亚细胞分离和FISH分析结果显示，circPDK1主要定位在细胞质。这些结果表明，circPDK1在PC中是一个丰富的、稳定表达的细胞质circRNA。

图2.circPDK1特性

 

03、缺氧环境下HIF1A促进外泌体circPDK1表达

有研究表明，在缺氧条件下，大量外显子衍生的circRNAs被HIF1A转录激活，其宿主线性基因由相同的pre-mRNA产生[5]。因此，作者推测低氧外泌体中大量的circPDK1可能是由于HIF1A激活的缘故。为了验证假设，作者首先发现circPDK1与其线性基因表达存在正相关。与此同时，circPDK1的表达也跟HIF1A的表达呈正相关。另外也发现HIF1A蛋白水平在PC中上调。作者又利用启动子序列分析工具(UCSC和JASPAR)，在circPDK1启动子区域的宿主基因中验证了两个潜在的缺氧响应元件(HREs) (ACACGTGCCC/GTACGTGAGG)。通过双荧光素酶报告实验确认HIF1A直接与circPDK1的两个转录起始位点相互作用。此外，对宿主基因上游的circPDK1启动子区域的两个预测HREs进行ChIP分析表明，HIF1A可以直接结合PDK1启动子区域，并在缺氧条件下增强宿主基因PDK1的转录。此外，HIF1A的敲低显著抑制了缺氧诱导的胞内和外泌体circPDK1的表达。ChIP实验结果表示，在缺氧条件下circPDK1可以被激活。总之，这些结果表明，低氧下HIF1A的激活会上调外泌体中circPDK1表达。

图3.缺氧环境下HIF1A促进外泌体circPDK1表达

 

04、细胞功能研究——缺氧下外泌体circPDK1促进PC细胞体外和体内增殖和迁移

体外细胞实验——为了阐明缺氧下，外泌体circPDK1在PC中的作用，从MIA PaCa-2和PANC-1细胞中分离出不同丰度的circPDK1外泌体，并分别在常氧/低氧条件下（常氧外泌体、低氧外泌体、低氧NC外泌体和低氧sh1-circPDK1外泌体）与相应的供体细胞共培养。结果发现，低氧下，外泌体中circPDK1显示高丰度；但是，低氧的sh1-circPDK1组较低氧NC组，circPDK1的表达量下调。接下来，进行集落形成、EdU、CCK-8和transwell检测。结果显示，低氧外泌体处理过的PC细胞活力和迁移能力增强/E-cadherin低表达/N-cadherin和vimentin高表达，而敲低circPDK1则逆转这一结果。

体内裸鼠实验——为了探讨外泌体circPDK1在体内的恶性作用，作者建立了裸鼠异种移植瘤模型(MIA PaCa-2细胞系)，并每3天静脉注射各组小鼠一次MIA PaCa-2产生的外泌体(常氧外泌体、缺氧外泌体、缺氧NC外泌体和缺氧sh1-circPDK1外泌体)。注射完成后，取小鼠肿瘤组织，发现低氧的NC外泌体（circPDK1高表达）增加了异种移植瘤的体积和重量以及肺转移结节，而低氧的sh1-circPDK1外泌体消除了这一结果。IHC检测PCNA、E-cadherin和vimentin发现，circPDK1高表达也促进PCNA和vimentin表达以及/N-cadherin低表达，而sh1-circPDK1结果与之相反。体内与体外实验结果一致，均表明缺氧诱导的外泌体circPDK1在体内促进PC细胞生长和迁移。

图4.缺氧下外泌体circPDK1对PC细胞功能的影响

 

05、机制探索1——在PC中circPDK1起miR 628 3p海绵的作用

鉴于circPDK1定位于细胞质，作者假设circPDK1可能通过作为miRNAs海绵发挥ceRNA的作用。通过circinteractome数据库和RIP实验验证了circPDK1与AGO2结合。这显示，circPDK1可能起到miRNA海绵的作用。随后，miRNA测序来筛选对照组和circPDK1过表达组中的差异表达的miRNA。在候选的miRNA中，miR-628-3p在过表达circPDK1的MIA PaCa-2细胞中被严重抑制，并且RIP实验也表明miR-628-3p可以与AGO2结合。作者进一步在TCGA和自己的数据中发现，miR-628-3p在PC肿瘤中显著下调并与与不良预后相关，并且与circPDK1表达呈负相关。作者通过双荧光素酶报告基因检测发现miR-628-3p和circPDK1存在结合。此外，亦做了circPDK1对miR-628-3p的启动子区域、pri-miRNA和pre-miRNA的影响，排除了circPDK1调控miR-628-3p的启动子活性或pri-miRNA和pre-miRNA生成。综上所述，circPDK1可能与miR-628-3p相互作用，在PC细胞中充当miR-628-3p的ceRNA海绵。

图5.circPDK1发挥miR 628 3p分子海绵作用

 

5-1、circPDK1作为miR-628-3p的ceRNA促进BPTF的表达

miR-628-3p在PC中的潜在功能和作用机制尚不清楚。因此，作者探索了circPDK1-miR-628-3p轴的潜在靶点—使用mirDIP、RNAInter、miRDB、miRTarBase和TargetScan数据库，预测BPTF、PURA、RBFOX2和ARSJ是miR-628-3p的潜在下游靶点。TCGA数据分析显示，BPTF的表达与miR-628-3p呈负相关，而PURA、RBFOX2和ARSJ结果不同。circPDK1缺失后的RNA测序结果显示，在37个下调的蛋白质编码基因中，BPTF是明显下调的基因之一。此外作者通过基因集富集分析(GSEA)发现，BPTF是c-myc转录所必需的。也有报道BPTF/c-myc轴参与了PC细胞生长[6]。双荧光素酶实验证实，miR-628-3p和BPTF存在结合，并且BPTF与circPDK1表达表达水平呈正相关，但是miR-628-3p的过表达会抑制circPDK1激活BPTF/c-myc轴。总体而言，circPDK1作为ceRNA通过发挥miR-628-3p海绵作用，释放miR-628-3p抑制的BPTF，从而调节BPTF/c-myc轴，促进PC生成。

图6.circPDK1作为ceRNA促进BPTF的表达

06、机制探索2——circPDK1与BIN1相互作用，增强BIN1的泛素化

作者使用RNA pulldown实验和银染研究了circPDK1是否通过与RNA结合蛋白相互作用来发挥其功能。结果发现大量的200、120、75、65和35 kDa蛋白与circPDK1相关。质谱分析显示，BIN1是circPDK1最可能的RNA结合蛋白之一。随后，RNA pulldown和免疫沉淀验证BIN1与circPDK1互作。FISH分析显示circPDK1在细胞质中与BIN1共定位。敲低circPDK1虽不改变BIN1的mRNA水平，但可上调BIN1蛋白水平，反之结果相反。作者特异研究了与BIN1相互作用的circPDK1区域，发现主要是circPDK1后半段序列与BIN1相互作用。因此，作者假设circPDK1可能通过与BIN1蛋白相互作用而破坏它。并通过实验验证，敲低circPDK1显著抑制BIN1的泛素化水平，反之则增强了BIN1的泛素化水平。作者又运用原子旋转等变记分器(ARES)分析circPDK1与BIN1结合的三维结构，并找出了它们的结合位置是在BAR区域，随后又设计了pulldown和IHC试验加以验证。综上所述，circPDK1可能通过与BIN1的BAR结构域相互作用来调节BIN1的稳定性，从而促进其泛素依赖性降解。

图7.circPDK1与BIN1相互作用，增强BIN1的泛素化

 

6-1、circPDK1作为支架，增强了BIN1与UBE2O的结合

为了进一步解析circPDK1介导的BIN1泛素化，作者通过质谱分析RNA puldown产物筛选出UBE2O（可显示E2泛素结合酶和E3泛素连接酶活性）。RNA pull-down和RIP确认了circPDK1与UBE2O之间的相互作用。而Co-IP(免疫共沉淀)结果显示UBE2O也与BIN1结合。巧的是，FISH和IF检测表明circPDK1、UBE2O和BIN1主要在细胞质中共定位。qRT-PCR结果显示，UBE2O不影响BIN1和circPDK1的RNA水平，但UBE2O下调后BIN1蛋白水平明显升高。而敲低circPDK1显著减弱了UBE2O对BIN1泛素化和降解的影响。IHC实验还显示，PC组织（circPDK1高表达）中UBE2O蛋白水平升高，且与BIN1呈负相关。总的来说，circPDK1可以作为一个支架，增强UBE2O与BIN1的结合，从而促进UBE2O对BIN1泛素化和降解的影响。

图8.circPDK1作为BIN1与UBE2O结合的支架

 

07、circPDK1通过激活c myc促进糖酵解

有报道讲，BIN1是一种肿瘤抑制因子，可与c-myc相互作用，限制c-myc的转录活性[7]。作者通过双荧光素酶实验验证，circPDK1和UBE2O可以通过降解BIN1蛋白激活c-myc的转录活性。为了探索这两个轴之间是否存在交叉激活，作者检测了BIN1和UBE2O对miR-628-3p和BPTF表达的影响。结果表明，BIN1和UBE2O不影响miR-628-3p或BPTF的表达。同时，miR-628-3p或BPTF不能在RNA或蛋白质水平调控BIN1或UBE2O，这表明circPDK1可以通过两个无交叉的轴激活c-myc。

已知c-myc是Warburg效应的关键介导因子，它直接激活各种糖酵解靶基因，以满足快速增殖和转移的需要[8]。因此，作者探索了circPDK1是否与糖酵解相关。通过qRT-PCR和Western blotting对糖酵解基因进行分析，结果发现，敲低circPDK1对这些糖酵解基因的表达没有明显的抑制作用，仅仅是减少乳酸和ATP的产生和葡萄糖的摄入，以及细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)。但是PET-CT扫描显示敲低circPDK1会显著抑制小鼠皮下肿瘤中的葡萄糖代谢，并且敲低circPDK1会抑制c-myc活性。进一步的研究发现，BIN1逆转了circPDK1过表达诱导的糖酵解，miR-628-3p结果与之类似，二者也均能抑制c-myc活性。同时，敲低circPDK1和过表达BIN1也会抑制UBE2O诱导的糖酵解电位。总的来说，这些数据表明c-myc介导了circPDK1在糖酵解中的作用。

图9.circPDK1通过激活c myc促进糖酵解

综上所述：circPDK1在低氧PC细胞衍生的外泌体中高度富集。高表达的circPDK1表达与PC患者不良预后密切相关。外泌体circPDK1通过促进细胞生长、转移和体内外糖酵解，在PC中具有促进肿瘤生长的作用。机制上讲，HIF1A通过激活宿主基因PDK1上调circPDK1，circPDK1通过调节miR-628-3p/BPTF轴和降解BIN1激活c-myc。这项研究为circRNA/miRNA/mRNA和circRNA-RBP相互作用的多样性提供了新的见解，并强调了其作为PC的生物标志物和治疗靶点的潜在用途。

摘要图

 

原文链接：

https://doi.org/10.1186/s13045-022-01348-7

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9023 0 Cell Mol Biol Lett | 蒋利与邱朝晖发现circ_0086296参与动脉粥样硬化作用机制 //www.xjpih.com/?p=8935 //www.xjpih.com/?p=8935#respond Wed, 19 Oct 2022 06:47:11 +0000 //www.xjpih.com/?p=8935 动脉粥样硬化(AS)是一种慢性严重的炎症反应和动脉壁损伤，也是大多数严重的心血管疾病的罪魁祸首，包括心肌梗死和中风[1,2]。异常内皮细胞(ECs)的丢失和功能障碍是AS的初始阶段，也是AS的关键病理特征之一。因此，了解内皮细胞动脉粥样硬化表型的分子机制可以探索潜在的治疗靶点。 
circRNA具有典型的稳定结构和长的半衰期。因此，circRNAs可能作为疾病的生物标记物。越来越多的证据表明，circRNA通过直接与蛋白质结合或通过海绵miRNA改变靶基因水平来调节发育。然而，circRNA生物发生和调控AS中ECs异常表型的机制仍不清楚。 
2022年9月23日，上海交通大学医学院附属同仁医院心血管内科蒋利与邱朝晖在Cellular & Molecular Biology Letters上发表了一篇题为circ_0086296 induced atherosclerotic lesions via the IFIT1/STAT1 feedback loop by sponging miR-576-3p的文章，在这篇文章中，作者揭示了 circ_0086296/miR-576-3p/IFIT1/STAT1参与了动脉粥样硬化的过程，并与动脉粥样硬化患者血清外泌体中 circ_0086296的高表达有关。 
 

数据库预测，获得目的circRNA

作者通过微阵列分析筛选了人类斑块组织和对照样本中的circRNA。发现与对照组相比，9个circRNA在人类斑块组织中的表达增加，而3个circRNA的表达降低。在这些差异表达的circRNA中，选择了4个用于qRT-PCR进一步检测：circ_0086296、circ_0009579、circ_0085558和circ_0052089。根据实验数据显示，人脐静脉内皮细胞的circ_0086296水平高于人主动脉VSMCs或THP-1细胞，因此用于进一步研究。 

circRNA表达研究

作者通过qPCR验证了氧化型低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞可促进circ_0086296的表达。并且发现与对照组相比，动脉粥样硬化小鼠主动脉中circ_0086296的表达水平升高，对其进行RNase R处理，发现具有抗性。FISH检测发现发现circ_0086296主要在细胞质中表达，并且与内皮相关标记CD31在人冠状动脉斑块组织和动脉组织中共定位。

 

图1.circ_0086296的验证与表征

 

circRNA表型研究

为了确定circ_0086296在人脐静脉内皮细胞表型调控中的生物学功能，作者建立了稳定的circ_0086296敲低和过表达细胞系，以及各自的对照。CCK-8检测显示，circ_0086296基因敲除逆转了氧化低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞活力的抑制作用，而circ_0086296-OE增加了这些抑制作用。Transwell和Scratch分析表明，circ_0086296基因敲除可减轻氧化低密度脂蛋白损伤的人脐静脉内皮细胞的运动，而circ_0086296-OE细胞具有相反的作用。 

下游miRNA研究

作者通过生物信息学分析预测了circ_0086296的ceRNA网络。通过重叠数据集，共筛选出65个miRNAs和11个基因。值得注意的是，miR-576-3p的结果特别令人感兴趣，荧光素酶检测实验表明，circ_0086296野生型报告和miR-576-3P模拟降低了荧光素酶活性，而circ_0086296突变型没有这种作用。RIP实验还表明，用抗AGO2抗体富集了miR-576-3p和circ_0086296。FISH结果表明，circ_0086296与miR-576-3P共存于人脐静脉内皮细胞的细胞质中。实验结果证实了circ_0086296是miR-576-3p的分子海绵。

 

图2.circ_0086296作为miR-576-3P的海绵

 

miRNA下游基因研究

circ_0086296与靶基因水平呈正相关，与miR-576-3p呈负相关。作者预测了可能的miR-576-3P靶基因，并对微阵列分析的基因进行了分析。从可能的miR-576-3P靶基因中选择了4个基因(BIRC3、CDC7、NEMP1和IFIT 1)。qRT-PCR结果表明，IFIT1在人斑块组织和ox-LDL处理的HUVEC中显著上调。因此，选择了IFIT1进行进一步分析。结果表明，过表达的IFIT1显著抑制了体外血管生成的能力，而sh-IFIT1逆转了这一效应。为了确定IFIT1是否是miR576-3p的有效靶点，使用了IFIT1 3‘非翻译区(UTR)荧光素酶报告基因(IFIT1-WT)和突变报告基因(IFIT1-mut)。发现IFIT1-WT和miR-576-3p模拟下调的荧光素酶活性，而IFIT1-mut没有这种作用，结果表明IFIT1是miR-576-3p的直接靶点。 

circRNA-miRNA-基因轴上表达与表型

为了进一步阐明circ_0086296在体内促进动脉粥样硬化病变中的作用，给动脉粥样硬化小鼠注射了表达sh-NC或sh-circ_0086296的慢病毒。作者发现sh-circ_0086296减少了动脉粥样硬化小鼠主动脉组织的脂质面积。Sh-circ_0086296感染抑制了circ_0086296的表达，增加动脉粥样硬化小鼠主动脉组织中miR576-3p的表达，降低IFIT1的水平。为探讨sh-circ_0086296在体内抑制动脉粥样硬化形成的分子机制，对动脉粥样硬化小鼠主动脉中STAT1-Sting信号进行了检测。体内和体外数据表明，circ_0086296下调介导了STAT1和STING表达的抑制以及STAT1、NF-κB和IRF3磷酸化的抑制。在AS小鼠中，感染表达sh-circ_0086296的慢病毒的斑块和内膜损伤区域被部分抑制。免疫组化结果显示，与sh-NC组相比，sh-circ_0086296组CD31表达增加，IFIT 1表达降低。IFT1的IF结果与IHC的结果一致。同时，酶联免疫吸附试验显示，感染sh-circ_0086296后，AS小鼠的炎症因子水平明显低于sh-NC组。这些数据共同表明，circ_0086296缺陷可能限制体内动脉粥样硬化病变的发展。 

外泌体研究

作者从患者和对照受试者的血浆中纯化了外泌体，与对照组相比，AS患者外泌体中circ_0086296水平升高，而miR-576-3p水平降低。为研究人脐静脉内皮细胞是否分泌含有circ_0086296的血管内皮细胞，从人脐静脉内皮细胞培养上清液中获取血管内皮细胞。与体内结果相似，发现氧化低密度脂蛋白处理的人脐静脉内皮细胞与对照组相比，外泌体中circ_0086296水平升高，而miR-576-3p表达较低。作者进一步研究了外泌体包装circ_0086296对人脐静脉内皮细胞动脉粥样硬化病变表型的调节。发现，含有sh-circ_0086296的外泌体能部分恢复人脐静脉内皮细胞的动脉粥样硬化病变表型，而含有circ_0086296-OE的外泌体诱导动脉粥样硬化病变表型。用qPCR检测细胞与sh-circ_0086296细胞来源的外泌体共培养后circ_0086296和miR-576-3p的表达。结果表明，在与sh-circ_0086296细胞来源的外泌体共培养的细胞中，circ_0086296的表达降低。与sh-circ_0086296细胞来源的外泌体共培养后，HUVEC中miR-576-3p的表达增加。总体而言，实验结果表明，外泌体含有circ_0086296-OE，而外泌体诱导了动脉粥样硬化病变表型。 

图3.circ_0086296通过miR-576-3P/IFIT1/STAT1诱导的动脉粥样硬化病变示意图

 

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