实用工具 – 888集团浏览器官网 - 888电子游戏 //www.xjpih.com Wed, 21 May 2025 09:37:22 +0000 zh-CN hourly 1 https://wordpress.org/?v=5.1.3 //www.xjpih.com/wp-content/uploads/2019/03/cropped-circRNA（透明）-2-32x32.png 实用工具 – 888集团浏览器官网 - 888电子游戏 //www.xjpih.com 32 32 汕头大学医学院附属肿瘤医院陈创珍团队发现circKEAP1作为关键的肿瘤抑制因子为OS患者提供了潜在治疗靶点 //www.xjpih.com/?p=11240 //www.xjpih.com/?p=11240#respond Wed, 17 Apr 2024 09:04:11 +0000 //www.xjpih.com/?p=11240 骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是最常见的恶性原发性骨肿瘤之一，常转移至肺部且对放化疗具有抵耐药性，患者预后较差。最近的研究表明，circRNA在细胞的生理和病理中发挥作用[1]，同时包括OS在内的多种骨癌中发下大量差异表达的circRNA，circTADA2A在OS组织和细胞系中都上调[2]等。然而，circRNA及甲基化修饰在调控OS的发生与干性的认识还处于初步水平，还需进一步的探索。

2024年2月21日，汕头大学医学院附属肿瘤医院陈创珍团队在JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH（IF=11.3）发表文章A tumor suppressor protein encoded by circKEAP1 inhibits osteosarcoma cell stemness and metastasis by promoting vimentin proteasome degradation and activating anti-tumor immunity。结果显示，作者通过微阵列分析技术鉴定OS与正常组织之间差异表达的circKEAP1（hsa_circ_0049271），在OS肿瘤中的表达下调，并与癌症患者更好的生存率相关。进一步分析发现circKEAP1含有777 nt长的ORF，并编码的新蛋白KEAP1-259aa。从机制上讲，KEAP1-259aa可通过与E3连接酶ARIH1相互作用促进波形蛋白酶体降解以此抑制OS细胞的增殖、侵袭。此外，circKEAP1与RIG-I相互作用，通过IFN-γ途径激活抗肿瘤免疫，为OS治疗提供了新的潜在靶点。

 

一、circKEAP1在OS组织中特异低调

作者通过3对OS及正常组织进行微阵列分析，并鉴定了一系列的差异表达的circRNA，通过GO富集分析，选择前5个差异表达的circRNA，并通过qPCR/divergent primer sanger测序/R酶消化富集实验及GEO数据库中发现circKEAP1(hsa_circ_0049271)是OS中明显低调及确定是反向剪切形成稳定的circRNA结构。其次作者通过核质分离及FISH实验检测到circKEAP1主要定位在细胞质中，同时卡普兰-迈尔生存分析（Kaplan-Meier survival analysis）/ROC曲线分析发现circKEAP1表达水平较高的OS患者的总体生存时间更长，circKEAP1可作为诊断OS的候选标志物。

图1. 微阵列分析鉴定OS相关的circRNA

  

二、circKEAP1抑制OS细胞的增殖、迁移和干性

作者通过CCK8/克隆形成/流式检测/细胞划痕/Transwell侵袭发现circKEAP1抑制OS细胞的增殖并增加了OS细胞的凋亡，进一步证实了对OS细胞迁移的抑制。同时使用异种移植模型/IHC说明了circKEAP1降低了OS细胞肺转移的感染能力并减弱肿瘤的生长。

图2. circKEAP1的表征及其在OS中的功能

  

三、circKEAP1可编码蛋白 KEAP1-259aa

作者进一步通过circRNADb数据库预测circKEAP1有一个777长度的ORF，可编码一个259aa的蛋白，并通过构建双荧光素酶/过表达FLAG标签载体/敲低载体/液相色谱-质谱/免疫荧光验证了circKEAP1的IRES活性和蛋白表达。同时使用KEAP1商业化抗体检测了8对OS组织发现与正常组织相比，OS组织中的KEAP1-259aa的表达水平较低。 

图3. circKEAP1编码一种新型蛋白质推测起在OS中发挥的机制

  

四、新蛋白KEAP1-259aa发挥肿瘤抑制作用

作者进一步分析KEAP1-259aa的生物学功能，通过过表达circKEAP及IRES、ATG突变载体/CCK8/流式检测/细胞划痕/Transwell侵袭，发现KEAP1-259aa抑制OS细胞的增殖和克隆形成及调节细胞迁移能力，并通过流式/WB检测相关干细胞标志物的下调及肿瘤球形成试验/裸鼠皮下注射实验发现该蛋白可抑制肿瘤的形成。

图4. KEAP1-259aa可抑制OS细胞的增殖、侵袭和干性

   

五、KEAP1-259aa通过与E3连接酶ARIH1结合促进波形蛋白酶体降解

作者为了进一步探究KEAP1-259aa抑制OS恶性肿瘤的分子机制，开展了基于质谱的甲醛交联实验，通过GO富集分析表明KEAP1-259aa结合蛋白与翻译后修饰有关，其中最显著的是vimentin波形蛋白和泛素转移E3连接酶ARIH1，并通过CO-IP/免疫荧光染色实验进一步验证它们之间的互作。作者也发现了过表达KEAP1-259aa降低了波形蛋白的表达水平，与对照相比，波形蛋白的降解速度更快，但是用CHX处理（蛋白质合成抑制剂），敲低ARIH1恢复了波形蛋白的表达。此外，KEAP1-259aa介导的波形蛋白稳定性下降被蛋白酶体抑制剂MG132逆转。同时用HA抗体检测GFP ip下的蛋白发现，KEAP1-259aa诱导了波形蛋白的泛素化水平修饰。为了进一步测试KEAP1-259aa介导的波形蛋白的泛素降解是否与其磷酸化水平有关，构建了波形蛋白的野生型及丝氨酸突变型载体，IP实验结果显示KEAP1-259aa对39aa突变位点的波形蛋白的泛素化调节水平降低。

图5. KEAP1-259aa与ARIH1相互作用促进波形蛋白降解

  

六、circKEAP1通过vimentin发挥抑瘤作用

作者用WFA处理OS细胞后，circKEAP1敲低明显抑制细胞的增殖、集落形成、迁移和干性均降低，细胞凋亡增强。此外，在体内和体外用vimentin转染细胞时，circKEAP1没有发挥抑瘤作用。综上所述，这些发现表明circKEAP1编码的KEAP1-259aa通过抑制vimentin发挥肿瘤抑制作用。

图6. circKEAP1通过降低波形蛋白水平抑制OS恶性肿瘤

    

七、circKEAP1的m6A甲基化修饰调控作用

作者为了探索控制OS中circKEAP1水平的详细机制，进一步用SRAMP预测了m6A位点（A565G），RNA pulldown和RIP实验表明，circKEAP1可以与m6A甲基化修饰因子：METTL3、FTO和YTHDF1/2相互作用，并在circKEAP1在A565上存在m6A修饰位点，并通过降低其甲基化时的稳定性来调节circKEAP1的表达。

图7. circKEAP1的表达受m6A甲基化调节

    

八、circKEAP1在OS细胞中通过RIG-I通路触发免疫防御反应

作者为了深入研究circKEAP1在OS中的下游调控机制，进行了RNA-seq，通过GO和KEGG/GSEA富集分析/qRT-PCR发现circKEAP1参与I型干扰素(IFN)和免疫信号传导。之前的研究发下RIG-1的缺失与癌症免疫逃逸有关，通过敲低RIG-1发现circKEAP1诱导的免疫通路相关基因表达水平下调；同时用WB/ELISA/人炎症因子抗体芯片发现circKEAP1可促进RIG-1、p-IRF3、CXCL10、CCL5等免疫调节因子的表达。进一步通过RIP/FISH实验，circKEAP1可通过自身的CARD结构域与RIG-1结合，并共定位在细胞质中，这些结果表明circKEAP1的过表达通过 RIG-1来调控OS中相关免疫基因的上调。

图8. CircKEAP1通过RIG-I激活细胞免疫应答

   

总结

作者通过一系列实验证明了circKEAP1可以抑制肿瘤的生长、侵袭和增殖，并通过编码一个新型蛋白KEAP1-259aa，其与波形蛋白结合并通过与ARIH1相互作用促进波形蛋白降解。更重要的是，circKEAP1通过RIG-I信号通路激活抗肿瘤免疫。这些结果表明circKEAP1是OS中的一个重要治疗靶点。

图9. circKEAP1可在OS细胞中的调控机制

  

原文链接

https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-024-02971-7

   

参考文献

[1] Soghli N, Qujeq D, Yousefi T, Soghli N. The regulatory functions of circular RNAs in osteosarcoma. Genomics. 2020;112(4):2845–56.

[2] Wu Y, Xie Z, Chen J, Chen J, Ni W, Ma Y, Huang K, Wang G, Wang J, Ma J, et al. Circular RNA circTADA2A promotes osteosarcoma progression and metastasis by sponging miR-203a-3p and regulating CREB3 expression. Mol Cancer. 2019;18(1):73.

]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=11240 0 KGETCDA丨这是一款可以在线使用的 circRNA-disease 预测工具 //www.xjpih.com/?p=10397 //www.xjpih.com/?p=10397#respond Thu, 24 Aug 2023 06:15:39 +0000 //www.xjpih.com/?p=10397 早些时候对circRNA-disease相关的数据库以及方法进行过盘点，虽然预测工具众多（>67个），然而对用户非常不友好。

详情请访问：circRNA-disease数据库与计算工具盘点

2023年8月16日，西安交通大学付来义团队发表在 Briefings in Bioinformatics （IF=9.5）的文章【KGETCDA: an efficient representation learning framework based on knowledge graph encoder from transformer for predicting circRNA-disease associations 】打破了这个尴尬的局面。

研究团队开发了一个用于预测 circRNA-disease关系的深度学习方法 KGETCDA(Knowledge Graph Encoder from Transformer for predicting CircRNA-Disease Associations)。整合了10多个非编码疾病关系数据库，构建了circRNA、miRNA、lncRNA与疾病的关系数据集，根据该数据集构建了生物学知识图；然后构建了Transformer（继CNN和RNN之后又一个高效的特征提取器）知识提取图层，精确地捕获高阶的交互信息；最后多层感知器被用来预测circRNA-disease associations(CDAs)。

经过评估，KGETCDA比其他最新的方法性能都要优越。

图A.AUC比较

图B.AUPR比较

图C.准确评估数量比较

最后，为了让大家享受到自己的研究成果，作者还开发了一个用户友好的网络平台HNRBase（网址：http://lab-fly.site/KGETCDA）。下图展示了网络平台的一些功能。

]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=10397 0 赵方庆、何春江等国内外知名环状RNA专家对环状RNA检测工具的评估报告以及使用指南 //www.xjpih.com/?p=10171 //www.xjpih.com/?p=10171#respond Fri, 21 Jul 2023 06:25:52 +0000 //www.xjpih.com/?p=10171

概述

2023年7月13日，OncoRNALab联合了众多国际知名环状RNA研究大咖在Nature Methods(IF=48.0)刊发了Large-scale benchmarking of circRNA detection tools reveals large differences in sensitivity but not in precision，研究团队对二代测序环状RNA检测工具进行了标准化测试。
OncoRNALab由比利时根特大学的Jo Vandesompele和Pieter Mestdagh教授负责监管，属于根特医学遗传学中心和癌症研究所的一部分。该实验室的研究旨在利用RNA进行诊断和治疗，目前大量研究集中于非编码RNA在癌症中的作用以及细胞外RNA在液体活检中的应用。该实验室试图通过高通量测序技术与生物信息学工具的结合来回答各种基础和转化研究的问题。

 

这篇文章很短，但是故事很长。

文章很短，文章只做了一件环状RNA研究者都会做的事：对高通量测序检测到的环状RNA进行低通量验证。

故事很长，本文联合了环状RNA领域的诸多大咖一起，通过3种低通量检测方法对16个高通量circRNA检测方法的精确性和敏感性等指标进行了评估。而这16个工具，来自不同的时间、不同的研究小组，见证了环状RNA领域的发展史；每一个工具的背后应该都有一段故事——叙说了开发者对环状RNA的认知和期许。

文章对3种人类癌症细胞系的total RNA进行了深度测序，通过16种知名的检测工具识别到了315312个环状RNA，随后通过三种正交的低通量验证方法：

qPCR

确定候选circRNA BSJ是否能够被检测到。

RNase R

证实所检测到的RNA是环状的而不是线性的。

amplicon sequencing

即PCR扩增后sanger测序，用于证实环状RNA BSJ序列对1516个预测的circRNAs进行了验证。结果显示，16种工具的准确性中值达到了98.8%、96.3%和95.5%，然而这些工具的敏感性和预测数量差异巨大。

评估过程与部分结果

文章的发起者让16个工具对应的作者团队利用自己的工具对3个深度测序的细胞系进行环状RNA预测（如下图）。随后，每个工具随机挑选80个BSJ counts>=5以及20个BSJ counts<5共100个环状RNA——总共1600个环状RNA用于验证。

一些环状RNA引物存在脱靶风险，将不被考虑用于验证，剩余1560个分子。

同时由于偶然原因，不同的工具，不同的细胞系，相同的circRNA被选中，最后1516个circRNAs被用于最后的验证。

每个工具具体的环状RNA精确性（验证率）如下图

敏感性评估如下图

敏感性和精确性的综合评估

更详细的结果请访问原文：
https://doi.org/10.1038/s41592-023-01944-6

小知识

中肯的建议

该项研究表明，3种验证方法都有各自的优势和偏差，也有一些环状RNA验证结果存在冲突（如下图）。
因此，作者表明
单纯的qPCR验证是不足够的；
qPCR+RNase R组合是OK的；
qPCR+amplicon sequencing更好。
当然，我们可以看到大部分文章，3种验证方法都开展了。
对于高通量环状RNA筛选工具，多个工具得到的交集可能有更高的概率被验证；然而，这种方式仍然无法避免假阳性结果的发生（如下图）。另外，文章也给出了一些工具的组合供研究者参考（文章附表7-9）。

表格链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-023-01944-6#MOESM4
文章作者给出了中肯的建议以供环状RNA研究者作为参考（如下表）。
同时，文章中检测以及验证的环状RNA都可以在github上获取到，地址为：

https://github.com/OncoRNALab/circRNA_benchmarking
以下是参与该研究的部分国内大咖清单
• 南京中医药大学，顾万君• 武汉大学，何春江

• 东南大学，温国霞

• 浙江大学，叶楚玉

• 复旦大学，杨力

• 上海中科院，袁国华

• 北京中科院，赵方庆

• 台湾中央研究院，莊樹諄

]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=10171 0 环状RNA十年丨你想了解的环状RNA生物信息学工具这里都有 //www.xjpih.com/?p=9789 //www.xjpih.com/?p=9789#respond Tue, 16 May 2023 06:38:39 +0000 //www.xjpih.com/?p=9789
序言
环状RNA自2013年两篇Nature发表后，该研究领域彻底被点爆，关于环状RNA研究的发表刊物是逐年上涨（如下图）。同时，十年间出现了大量优秀的生物信息学工具。

  

2021年Briefings in Bioinformatics也发了类似的总结《The bioinformatics toolbox for circRNA discovery and analysis》，文章中描述了大约100个生物学工具。

2023年5月3日，发表在Briefings in Bioinformatics期刊的文章Computational approaches for circRNAs prediction and in silico characterization为我们梳理了过去十年环状RNA研究常用的生物信息学研究工具，覆盖了整个环状RNA的研究领域。
  

<有了这篇文章，我们再也不用秃头整理资料了！\^o^/>

当然，环状RNA的故事并不是一篇文章能够讲完的，小编也根据自己过往经验补足了一些文章中没有出现的工具。那接下来就让我们一起阅览一下环状RNA的生物信息研究工具，捋一捋哪些是我们用过的，哪些将来可以用到课题研究中~
PS:本文较长，约4500字，【尾声：一图胜千言】用图对文章原文提到的工具进行了概述。 

环状RNA起源

要研究环状RNA，那我们不得不知道环状RNA是如何生成的。目前大部分研究人员已经自动默认环状RNA主要是线性RNA转录后的产物，环状RNA分子主要通过侧翼内含子互补配对、RBP诱导侧翼内含子以及套索驱动3种方式产生（如下图），且根据环状RNA的基因组结构分成了EcircRNA、EIcircRNA、IcircRNA等不同亚型。

研究者还发现了哪些种类的环状RNA呢，请查看：
非经典环状RNA | 环状分子研究新的突破口？
  

  

环状RNA识别

了解环状RNA起源之后，我们已经明白环状RNA与线性RNA分子序列上最大的区别是BSJ(Back-SplicedJunction)。最初Salzman等人进行生信分析时无意间发现无法比对到基因组的bulk RNA-seq序列存在大量BSJ，于是大胆推测出这些序列来源于环状RNA分子。 

BSJ是识别环状RNA分子的关键，所有预测环状RNA分子的软件——从最初的find_circ到现在常用的CIRI、DCC、CRICexplorer等工具——都基于该理念（请看经典图）。

 

  

当然，不同的软件除了基本思想一致外，还存在两个门派：一个是Split-alignment based approach，另一个是Pseudoreference based approach。由于BSJ无法比对到正常参考基因组，第一种方法将chimeric reads或unmapped reads分割后再一点点与参考基因组比对；第二种是先推测BSJ的外显子，再将这些外显子拼接成假基因组（pseudo reference），然后再将 chimeric reads或unmapped reads比对到假基因组上（如下图）。

 

  
人工智能的产物ChatGPT都已经火出圈了，环状RNA识别怎么能少得了用机器学习的方法。目前已经有PredcircRNA、WebCircRNA、DeepCircCode以及StackCirRNAPred四个工具采用了机器学习的方法。下表就列出了近十年用于识别circRNA的工具：

 

这么多工具，到底哪一款最好呢？ 

2017年

PLOS COMPUTATIONAL BIOLOGY发表的文章《A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools》对11款工具进行了比较，发现DCC、CIRCexploer、MapSplice、NCLScan、PTESFinder假阳性率较低，而CIRI、CIRCexplorer、KNIFE、Segemehl、PTESFinder具有较高的敏感性。

2018年

随后，另一篇文章《Improved circRNA Identification by Combining Prediction Algorithms》也对11款工具进行了敏感性和特异性的评估，发现大多数方法能检测到的circRNA丰度中值为14-20 reads，而DCC、circRNA_finder、UROBORUS只有11、9、5reads。
然而，不同的软件侧重点不一样，且有些软件一直在更新升级，因此很难认定某一款软件就是最优的，一般采用多个软件组合的方式对circRNA进行检测和筛选。CircComPara2和circRNAwrap这两款软件就整合了多款工具用于circRNA识别。由于并没有一款完美的软件，并且新软件可能存在新的问题，所以大家在课题研究时更多的是沿用之前使用过的软件，这点可以从引用率上体现出来。

 

环状RNA可变剪切与重构

前面的工具主要用于识别BSJ，但环状RNA中间序列是存在可变剪切的。然而，二代测序很难捕获环状RNA序列全长序列。因此，一些工具被开发出来识别环状RNA的可变剪切事件，包括CIRICexplorer3/CIRI-AS等；另一些工具被用于环状RNA的全长构建，包括CIRI-full/circAST/psirc/CYCLeR等。

 

环状RNA全长测序技术

2021年连续发表了4篇关于环状RNA全长测序的策略，用于对环状RNA全长识别与定量以及可变剪切事件的检测，分别包括：• CIRI-long

• circNick-LRS/circPanel-LRS

• circFL-seq

• isoCirc

 

关于这些技术的解读以及优劣势circRNA公众号之前已经解读了许多了，大家感兴趣的话可以阅读以下内容：
circRNA研究新策略 | 三代测序是否能引领circRNA走向未来
Nat Protoc丨中国科学院北京生命科学研究院赵方庆教授团队提出环状RNA全长转录本解析技术
Nature Biotechnology | 基于三代测序技术分析circRNA全长
新风尚 | circFL-seq —— Nanopore 检测全长环状 RNA 新策略
重量级文章！Nanopore circRNA研究又见刊啦

 

在环状RNA全长识别、可变剪切分析以及表达定量等方面，三代测序技术有二代测序无法比拟的优势。高通量检测技术Illumina-basedRNA-seq/microarray/NanoString能检测定量BSJ序列，然而它们无法检测序列长度>300nt的环状RNA全长结构；而不同长度的环状RNA，纳米孔测序技术都能胜任。除此之外，三代测序还能够通过RNC建库检测正在翻译的环状RNA分子，并且能通过direct技术在一定程度上捕获到RNA修饰。

 

技术服务 | circRNA全长纳米孔测序

  

目前关于三代测序对环状RNA修饰的文章较少，感兴趣的童鞋可以查看文章《Profiling of circular RNA N6-methyladenosine in moso bamboo(Phyllostachys edulis)using nanopore-based direct RNA sequencing》。

 

环状RNA结构与体外制备

大家不太熟悉RNA结构研究的话，可以阅读文章《Recent advances in RNA structurome》。“结构决定功能”，特别是要将mRNA2.0技术服务于临床医学，我们需要先对候选环状RNA进行解构。

 

环状RNA全长测序技术解决了得到环状RNA全长序列（即一级结构）的挑战，为后续环状RNA功能研究提供了结构基础，例如预测miRNA的结合位点、RBP的结合位点。然而，对更高级的环状RNA结构的解析，才利于预测环状RNA功能解析，例如实现分子docking。另外，环状RNA的体外制备需要对环状RNA结构进行解构，这已经被应用到反义环状RNA的设计与应用、环状RNA作为药物靶点、可翻译的环状RNA框架等多个领域。

 

技术服务 | circRNA体外制备

 

还不了解什么是环状RNA体外制备？那就先看看：
「挑战者circRNA」下一代RNA疗法新秀崛起
关于环状RNA在生物医学中的应用大家可以查看：
Cell综述 | 陈玲玲综述环状RNAs研究方法和应用
环状RNA二级结构的预测比较常用到的是RNAfold和Mfold，三级结构常用的工具有RNAcomposer（在线版本最长只能预测500nt）、3dRNA等，今年3月斯坦福大学团队更是推出了堪比AlphaFold的工具ARES来准确预测RNA三级结构。

另外，值得一提的是，我国在人工智能应用于生物医学的研究也走在了世界前沿。百度出品的深度学习算法LinearFold能准确预测RNA的二级结构，而5月2日公布的RNA序列设计软件LinearDesign更是登顶Nature。相信这些新的工具将会为环状RNA的研究注入新的活力，同时加速环状RNA在医药方面的开发。

Nature丨斯微生物与百度等单位跨界发表重磅文章：AI算法赋能mRNA序列设计，人工智能加速circRNA药物开发

 

环状RNA表达定量、标准化与差异分析

环状RNA相比线性分子mRNA和lncRNA更难定量。大量bulk RNA-seq数据显示，环状RNA只占整个样品文库的极少部分，其中间序列要受线性分子的影响，定量只能认准BSJ。因此，目前环状RNA定量最佳的建库策略应该是先通过RNase R等策略去除线性，只富集环状RNA分子。

 

产品推荐 丨RNA制备工具酶系列之RNase R

 

环状RNA定量工具已经被集成在识别工具中，一般这些工具最后会输出每个样品的reads count值，有些还会给出CPM(counts per million)等标准化后的值。环状RNA表达的标准化和线性分子没有区别，唯一需要注意的是，由于环状RNA表达很低，因此在进行差异表达前过滤时通常阈值比线性分子低，例如circRNA CPM>0.1。差异分析受表达量以及表达分布的影响，目前最常用于环状RNA差异表达的工具仍是edgeR与 DESeq2，当然也有另外一些新工具被开发出来，例如CircTest。到底哪种分析方法更适合环状RNA呢？今年1月，Brief in Bioinformatics发表的《Systematic benchmarking of statistical methods to assess differential expression of circular RNAs》对现有的一些差异分析方法进行了评估，有兴趣的童鞋可以看一看。

 

环状RNA功能预测

环状RNA功能的机制众多，大家最熟悉且研究最多的有三个：

作为miRNA的海绵

关于circRNA-miRNA互作的预测工具，当前大家还是习惯用于mRNA的预测工具，例如miRanda/TargetScan/RNAhybird等；一些工具进行了简单创新，对已有的软件和数据进行了整合，例如Circr整合了miRanda以及RNAhybrid以及AGO结合位点，CRAFT整合了miRanda和PITA以及AGO结合位点；也有一些应用了机器学习算法，例如基于深度的GCNCMI、NGCICM等。

与RBP互作

环状RNA的整个生命周期都有蛋白质的参与，且环状RNA也能通过与蛋白质互作发挥功能。然而，目前环状RNA与RBP的互作研究手段仍具有很大的局限性，可使用工具也比较有限。高通量测序中的RIP-seq和CLIP-seq能够捕获RBP结合的circRNA，针对这两种高通量数据，circRIP被开发出来用于环状RNA的挖掘。

另外，基于已有的研究信息，一些预测工具也被开发出来。catRAPID v2整合了大量环状RNA与RBP信息，是一款非常常用的在线circRNA-RBP预测工具；基于CLIP-seq以及机器学习的工具也频频出现，例如CRIP、CircSLNN、CCSCRSites、Clirc、circ-pSBLA、iCircRBP-DHN以及RBPsuite等，除了个别工具存在在线版本（例如RBPsuite）方便使用，其他工具使用难度都比较大，且RBP分子仅仅局限于37RBP（CRIP收集的CLIP-seq训练集）。

另外，通过circRNA pull-down+质谱的方法可能是一种更有效地方法研究某个环状RNA与哪些RBPs互作。

蛋白质翻译

虽然最初研究者将环状RNA定义为非编码分子，然而有许多环状RNA被预测可能翻译蛋白质。事实上，目前已经有超过40个人类环状RNA被报道能够翻译蛋白质且发挥功能。 

关于一个circRNA是否能够翻译，我们可以通过CPAT、CPC2等工具先进行翻译潜能预测；另外我们可以用ORFfinder进行ORF的识别。值得注意的是，环状RNA的ORF可能覆盖环化位点BSJ，因此在进行操作时可能需要重复最多4次序列以避免错过有效的ORF或无终止密码子的ORF。

 

环状RNA的翻译不依赖于帽子结构，被归为“非经典”的形式，目前已发现大约3种翻译机制，包括：

– IRES驱动

– m6A驱动

– 滚环翻译（无终止密码子）

 

而关于IRES的预测，常用的生信工具有VIPS、IRESfinder、IRESPred、IRESpy、CircPrimer以及DeepCIP；而m6A位点预测常常用SRAMP以及m6Apred；至于滚环翻译的驱动机制目前仍有待进一步研究，并没有相应的工具帮助识别该现象。

另外，Ribo-seq数据也可能存在环状RNA的序列片段，为翻译提供线索，我们可以通过CircPro、CircCode等工具识别潜在翻译的环状RNA；但Ribo-seq文库太短，很难捕获到环状RNA的信息，RNC-seq可能是一种更有效的手段。

目前我们对环状RNA功能认识仍然有限。虽然有 circFunDb等数据库收集环状RNA功能，但由于环状RNA数量太多且一般被作为调控分子，因此，目前仍未形成像Gene Ontology和KEGG那样系统的功能和通路数据库。所以，环状RNA关于功能和通路注释大多通过以下方式开展：

• 对circRNA来源基因（宿主基因）开展 GO/KEGG/……等注释；• 构建circRNA-miRNA-mRNA网络，通过mRNA来进行GO/KEGG注释；

• 对circRNA cis调控基因（许多文献非编码 RNAcis调控基因定义为基因组区域<10kb）进行GO/KEGG/……等注释；

• 对circRNA trans调控基因或表达相关基因进行 GO/KEGG/……等注释；

• ……

关于GO/KEGG/……注释以及富集的工具已经有很多了，但比较常用的可能还是R包 clusterProfiler、在线工具DAVID、在线工具 g:profiler等。

 

环状RNA实验验证

环状RNA的验证、过表达以及敲低实验关键是设计特异的环状RNA序列，主要包括环状RNA引物设计和siRNA设计。其中CircPrimer是一款 Windows版本的环状RNA引物设计工具，而 circInteractome针对circBase数据库中的环状 RNA进行了引物设计，同时circInteractome还包含了siRNA的信息。

 

环状RNA数据库

环状RNA研究十年间已经发表的数据库差不多有 60个，之前已经作了比较详细的总结，请查看：

十年环状RNA | 史上最全！数据库汇总

目前各个数据库并没有统一环状RNA的命名，且参考基因组版本也存在差异——大多数使用的是 hg19版本，有一些采用了hg38版本。对此，今年年初，陈玲玲等研究者就该问题给出了环状RNA命名规范的建议，这将有利于环状RNA社区间的交流。

NCB丨陈玲玲研究员等统一环状RNA命名规范，推动环状RNA研究交流和发展

环状RNA可视化工具

目前关于环状RNA可视化的工具并不多，主要集中在展示环状RNA与宿主间的关系：• Windows版本的CircView，用于展示环状RNA 的基因组序列结构，同时可以标注miRNA结合位点以及RBP结合位点；

• shiny版本的circASViewer，用于查看环状RNA可变剪切事件的小工具；

• shiny版本的circASViewerStatic，该工具与 circASViewer是姊妹工具，能够生成环状RNA可变剪切事件的静态图；

• Rcirc是一个R包，可以像IGV一样可视化环状 RNA的测序数据；

• 在线版本的circVIS主要展示环状RNA与宿主的关系，更像一个数据库（目前无法使用）；

• ……

另外，如果要绘制环状RNA与其他分子的互作图，Cytoscape软件是大家的首选。

 

尾声：一图胜千言

下图对文章原文提到的工具进行了概述，分别从环状RNA研究热度、识别工具、数据库和下游分析工具4个方面以及时间轴等多个维度对环状 RNA生物信息工具进行了总结。

 

  

各位看官在环状RNA研究中都用到过哪些工具呢？欢迎留言讨论~

]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9789 0 Mol Cancer丨李立教授发现circCCAR1促进肝细胞癌CD8+T细胞功能紊乱和耐药性 //www.xjpih.com/?p=9536 //www.xjpih.com/?p=9536#respond Tue, 04 Apr 2023 07:47:19 +0000 //www.xjpih.com/?p=9536 肝细胞癌（HCC）已成为世界上最恶性的肿瘤之一，是一种高度致命的癌症。环状RNA （circRNAs）是一种具有闭环结构的非编码RNA，通过作为miRNA的分子海绵或与蛋白质结合来调节生物过程，也参与细胞增殖、分化、凋亡、侵袭等。circRNA可被包裹成外泌体，参与细胞间信号传递，促进多种肿瘤的恶性进展。CD8+T细胞功能障碍是肝细胞癌（HCC）免疫逃逸的主要因素。然而，外泌体来源的环状RNA对CD8+T细胞功能障碍的影响有待进一步探索。

2023年3月，昆明市第一人民医院&昆明医科大学附属医院肝胰胆外科李立教授课题组在Molecular Cancer（IF=41.444）发表文章Exosome-derived circCCAR1 promotes CD8+ T-cell dysfunction and anti-PD1 resistance in hepatocellular carcinoma。作者研究发现，在HCC肿瘤组织和外泌体中存在的环状RNA，通过circCCAR1/miR-127-5p/WTAP反馈环路上调WTAP，促进肿瘤生长和转移。HCC细胞以hnRNPA2B1依赖方式分泌circCCAR1可被活化的CD8+T细胞吸收，通过增强PD1蛋白的稳定性，造成CD8+T细胞的功能障碍。研究还确定了EP300和EIF4A3作为circCCAR1生物合成的促进因子，WTAP介导的m6A修饰作为circCCAR1的稳定剂。文章阐述了外泌体衍生circCCAR1促进肝细胞癌CD8+T细胞功能紊乱和anti-PD1的耐药性机制。

circCCAR1在HCC组织中高表达

首先，作者对HCC患者和健康对照组的血清外泌体进行circRNA微陈列检测其表达谱。选择HCC患者血清中外泌体表达量最高的circCCAR1（hsa_circ_0000240）进行下一步分析。作者通过circBase数据库、RT-PCR和Sanger测序确定了circCCAR1的环化位点。放线菌素D验证circCCAR1稳定性。RNA荧光原位杂交FISH验证其定位细胞质。circCCAR1在HCC临床样本和细胞系中的表达量增加。综上所述，circCCAR1在HCC组织中高表达。

图1 circCCAR1在HCC组织中高表达

 

 

circCCAR1在体内外均促进HCC的生长

作者对circCCAR1在HCC中的可能功能进行研究。circCCAR1过表达促进细胞增殖并增强HCCLM3和SK-Hep-1细胞的集落形成能力。circCCAR1的过表达促进了异种移植肿瘤的生长。这些数据表明，circCCAR1促进了HCC在体外和体内的生长。

图2 circCCAR1在体内外均促进HCC的生长

 

 

circCCAR1在体内外均能促进HCC的转移

转移是癌症的一个标志，HCC的转移严重损害了HCC患者的预后。作者研究发现circCCAR1的过表达可以增加HCC细胞的迁移和侵袭能力，而其缺失则降低了细胞的迁移和侵袭能力。在小鼠模型中，circCCAR1过表达组表现出更多和更严重的转移结节，而其沉默则降低了转移结节数量。总体而言，该研究揭示了circCCAR1在加速HCC细胞侵袭方面的重要性。

图3 circCCAR1在体内外均能促进HCC的转移

 

 

EP300介导的H3K27ac促进HCC中circCCAR1的表达

H3K27ac组蛋白乙酰化在调控HCC的进程中发挥着重要作用，可以控制circCCAR1或CCAR1的表达。组蛋白乙酰转移酶抑制剂减少了CCAR1 mRNA和circCCAR1水平。EP300介导的组蛋白乙酰化激活增加了circCCAR1的表达。结果表明，EP300介导的组蛋白乙酰化激活增加了circCCAR1的表达。

图4 EP300介导的H3K27ac促进HCC中circCCAR1的表达

 

 

EIF4A3促进circCCAR1的生成

RBPs与circRNA的相互作用可调节circRNA产生。研究通过Circ Interactome预测发现EIF4A3可结合到circCCAR1的上游、反向剪接连接位点和下游侧翼序列，并证实EIF4A3能与一个上游假定的结合位点、背剪接连接位点和一个下游假定的结合位点结合。MS2 RNA pull-down实验结果表明，EIF4A3与circCCAR1的上游和下游序列结合。EIF4A3过表达可增加HCC细胞中circCCAR1水平，敲低EIF4A3则相反。RIP和生物素标记RNA pull-down实验佐证了EIF4A3与circCCAR1的相互作用。

图5 EIF4A3促进circCCAR1的生成

 

 

WTAP介导的m6A修饰通过IGF2BP3增强了circCCAR1的稳定性

MeRIP-qPCR验证了circCCAR1中m6A的富集。作者发现用MAO靶向circCCAR1五个不同位点的处理使HCC细胞表现出更低的circCCAR1水平，RIP和生物素标记的RNA pull-down实验也验证WTAP、IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3四种蛋白都富集在circCCAR1复合物中。随后，作者探索WTAP-m6A-IGF2BP3轴在HCC中调控circCCAR1失调的潜在机制，发现WTAP敲低显著降低circCCAR1的m6A修饰和IGF2BP3对circCCAR1的结合，表明IGF2BP3对circCCAR1的结合依赖于WTAP介导的m6A修饰。总之，WTAP介导的m6A修饰通过IGF2BP3增强了circCCAR1的稳定性。研究也发现circCCAR1通过靶向miR-127-5p上调WTAP在HCC细胞中的表达。

图6 WTAP介导的m6A修饰通过IGF2BP3增强了circCCAR1的稳定性

 

 

hnRNPA2B1介导的circCCAR1包装成外泌体

作者发现肝癌患者血清与肝癌患者肿瘤组织中circCCAR1表达水平呈正相关，可作为预后诊断指标。外泌体抑制剂对HCC细胞中circCCAR1的水平没有影响。HCC细胞中circcCCAR1的过表达提高了外泌体circCCAR1的水平，而circCCAR1的敲低降低了外泌体circCCAR1的水平。总之，这些结果表明circCCAR1可以被包装成外泌体。作者进一步探讨了circCCAR1被包裹成外泌体的潜在机制。通过RIP和RNA pulldown实验，circCCAR1可以与hnRNPA2B1结合。此外，circCCAR1在hnRNPA2B1缺失的HCC细胞中表达增强，而外泌体表达减少。总之，circCCAR1可以以hnRNPA2B1依赖的方式被包装成外泌体。

图7  hnRNPA2B1介导的circCCAR1包装成外泌体

 

 

外泌体circCCAR1加速抗肿瘤CD8 + T细胞的衰竭

肿瘤细胞分泌的外泌体可以通过调节免疫应答来调节肿瘤的进展，其中CD8+T细胞被认为是最重要的抗肿瘤细胞类型。因此，作者研究了外泌体circCCAR1对CD8+T细胞的影响。研究发现HCC细胞的外泌体被活化的CD8+T细胞短暂吸收。外泌体circCCAR1共培养降低活化CD8+T细胞中穿孔素和颗粒酶B的蛋白水平，抑制活化CD8+T细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的分泌。结果显示，外泌体circCCAR1抑制CD8+T细胞增殖，促进其凋亡，降低其细胞毒性和细胞因子分泌，促进活化CD8+T细胞的功能障碍。

图8 外泌体circCCAR1加速抗肿瘤CD8 + T细胞的衰竭

 

 

circCCAR1促进HCC对anti-PD1治疗的耐药性

过表达circCCAR1通过与β-catenin结合促进PD-L1转录，从而抑制CD8+T细胞功能并支持肿瘤生长，而其敲低可增强CD8+T细胞功能并减缓肿瘤进展。此外，circCCAR1也参与了肝癌对anti-PD1治疗的抗性，并且与CD8+T细胞浸润在肝癌组织中呈负相关。

为了探讨circCCAR1在anti-PD1治疗中的作用，我们构建了HuNSG小鼠异种移植模型。研究发现，携带过表达circCCAR1细胞的HuNSG小鼠外周血外泌体circCCAR1增加，CD8+T细胞低于对照组（图9B）。circCCAR1高表达的异种移植小鼠对PD1治疗有耐药性，生存时间更短。综上所述，circCCAR1促进了HCC的anti-PD1治疗耐药性。

图9 circCCAR1促进HCC对anti-PD1治疗的耐药性

 

总结

综上所述，circCCAR1和CCAR1在HCC中增强，可作为HCC患者的预后指标。circCCAR1/miR-127-5p/WTAP正反馈回路增强了HCC的生长和转移。HCC细胞分泌的外泌体circCCAR1可被活化的CD8+T细胞吸收，通过增强PD1蛋白的稳定性，促进CD8+T细胞的功能障碍。此外，HCC细胞中CCAR1蛋白表达的增加通过结合β-catenin促进PD-L1的转录，这可能会增强anti-PD1治疗的耐药性。因此，靶向外泌体circCCAR1或CCAR1可能是一种新的策略，以最大限度地提高HCC患者的免疫治疗效率。

图10 circCCAR1介导的HCC免疫抑制模型

原文链接：

https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-023-01759-1

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9536 0 Cell Death Dis | circIFNGR2或成为抑制结直肠癌患者耐药的一种新的治疗策略 //www.xjpih.com/?p=9273 //www.xjpih.com/?p=9273#respond Fri, 17 Feb 2023 08:05:11 +0000 //www.xjpih.com/?p=9273
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。临床上，近一半的CRC患者中发生癌转移，致使死亡率较高[1]。因此，迫切需要更有效的诊疗策略以及精准医疗，在分子水平上分析结直肠癌发生、发展、侵袭、转移和复发的机制。

环状RNA(circRNAs)是一类新型的非编码RNA，通过在5端和3端之间的共价连接形成闭环，circRNAs可以作为miRNAs海绵，与RNA结合蛋白相互作用，调节mRNA的稳定性，参与基因转录和蛋白质翻译[2]。鉴于circRNA的特点，其可能在某些疾病，特别是癌症中发挥新型分子标记的作用，实际上在不同类型的癌症中都有报道，包括胃癌、乳腺癌、CRC和肝细胞癌等。

2023年1月，广州南方医科大学南方医院李婷婷教授在Cell Death & Disease发表文章：CircIFNGR2 enhances proliferation and migration of CRC and induces cetuximab resistance by indirectly targeting KRAS via sponging to MiR-30b。文章介绍，CRC是世界上最常见的恶性肿瘤，并显示出西妥昔单抗耐药性。而作者发现，circIFNGR2在转录后通过海绵miR-30b间接调控靶基因KRAS，诱导结直肠癌细胞对西妥昔单抗的耐药。本研究提示，抑制circIFNGR2可能是抑制恶性CRC患者西妥昔单耐药的一种治疗策略。

1、circIFNGR2在结直肠癌中表达上调 

首先作者试验验证，circIFNGR2是反向剪切形成。并且，与正常组织相比，CRC肿瘤组织circIFNGR2表达显著升高；而CRC癌旁组织和CRC组织关于circIFNGR2的qPCR结果与此一致。

 图1. circIFNGR2在结直肠癌中表达上调

 

2、circIFNGR2正向调控CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力 

作者分别设计过表达和敲低circIFNGR2，无论是在离体的CRC细胞系中，还是在在体的小鼠模型中，验证circIFNGR2对于CRC细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果发现，circIFNGR2在CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力中具有显著的正向调控作用。

图2. circIFNGR2促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭

 

3、circIFNGR2海绵抑制miR-30b的转录调节活性  

作者使用starBase网站，预测circ_IFNGR2可以与miR-30b结合。随后作者分别构建野生型和突变型载体，通过荧光素酶报告基因实验验证circ_IFNGR2与miR-30b存在结合；FISH实验结果也显示circIFNGR2和miR-30b在细胞质中明显共定位。此外，RNA pulldown实验证明，靶向circIFNGR2的生物素化探针可以同时下拉HCT8和CACO2细胞中的miR-30b。RIP结果显示，在过表达miR-30b的细胞中，被anti-Ago2靶向miR-30b拉低的circIFNGR2显著富集。上述实验均证明，circIFNGR2与miR-30b的直接结合，并能够反向调控miR-30b。

鉴于miR-30b在CRC中作为抑癌基因发挥作用，作者接下来进行了一系列细胞功能测定，以探索miR-30b是否可以逆转circIFNGR2对CRC细胞功能的影响。正如预期的那样，无论是在体实验还是离体实验，均证明，miR-30b对CRC细胞侵袭和增殖凋亡能力的影响同circIFNGR2相反，并且circIFNGR2的加入，能够逆转miR-30b对CRC细胞的作用。综上所述，circIFNGR2可以通过靶向miR-30b在体内和体外影响CRC细胞的功能。

图3. circIFNGR2海绵抑制miR-30b的转录调节活性

 

4、circIFNGR2通过靶向miR-30b影响KRAS的表达 

KRAS可以通过激活下游AKT信号促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。circIFNGR2可增加CRC细胞中KRAS的mRNA水平。Western blotting检测相应KRAS下游信号蛋白如p-ERK和p-AKT的蛋白表达水平发现，circIFNGR2过表达促进p-ERK和p-AKT蛋白表达水平上调。此外，在WT-KRAS CRC患者中，circIFNGR2可上调KRAS的表达，激活下游AKT信号通路，促进CRC细胞对西妥昔单抗的耐药。

作者进一步验证了circIFNGR2、miR-30b和KRAS之间的关系。结果显示，内源性miR-30b被靶向KRAS的生物素标记探针拉低。在HCT8和CACO2细胞中进行的Anti-Ago2 RIP实验显示，抗ago2对miR-30b的抑制作用下，KRAS大量富集。提示miR-30b可下调KRAS的表达。然而，在CRC细胞中转染circIFNGR2逆转了KRAS的下调。相反，在circIFNGR2过表达组中，加入miR-30b则降低了KRAS的水平。综上所述，虽然miR-30b可以下调KRAS的表达，但circIFNGR2可以逆转miR-30b下调KRAS的作用。

图4. circIFNGR2通过靶向miR-30b影响KRAS的表达

 

5、circIFNGR2在CRC细胞中诱导西妥昔单抗治疗耐药 

西妥昔单抗可诱导肿瘤细胞凋亡，从基因水平抑制细胞过程，也可与NK细胞等效应细胞的Fc片段受体结合，通过抗体依赖细胞细胞毒性杀伤肿瘤细胞。

考虑到circIFNGR2有助于CRC中癌细胞的特性，作者接下来研究circIFNGR2是否导致西妥昔单抗治疗耐药。CCK8、transwell和集散形成实验显示circIFNGR2增强了CRC细胞的增殖和迁移能力。然而，西妥昔单抗治疗后，对照CRC细胞的增殖和迁移能力下降，而circIFNGR2过表达的CRC细胞的增殖和迁移能力未下降。这提示，circIFNGR2过表达可促进西妥昔单抗化疗耐药性。CRC细胞创面愈合试验的统计分析表明，西妥昔单抗处理后，未转染circIFNGR2的细胞迁移能力明显降低，而circIFNGR2过表达组细胞迁移能力无明显影响；流式细胞仪检测凋亡的结果也与此一致。体内裸鼠异种实验也进一步印证了circIFNGR2在西妥昔单抗耐药中的作用。综上所述，circIFNGR2通过靶向KRAS诱导CRC细胞对西妥昔单抗的耐药。

 

图5. circIFNGR2在CRC细胞中诱导西妥昔单抗治疗耐药

 

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41419-022-05536-8

参考文献：

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin.2020;70:7–30.

[2] Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet.2019;20:675–91.

转载请联系邮箱授权：circRNA@163.com

]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9273 0 外泌体circRNA促进了PCa的肿瘤发生，为前列腺癌提供了一个新治疗靶点！ //www.xjpih.com/?p=9263 //www.xjpih.com/?p=9263#respond Wed, 15 Feb 2023 09:24:01 +0000 //www.xjpih.com/?p=9263
前列腺癌(PCa)是男性最常见的实体器官恶性肿瘤。前列腺特异性抗原(PSA)在做PCa筛查试验时，往往导致患者的过度诊断和过度治疗[1]。并且，大约30%的前列腺癌病例会发展为转移性前列腺癌。因此，迫切需要探索PCa发展背后的详细机制。环状RNA (circRNA)具有独特的共价单链闭环结构。高通量测序已经确定许多circRNAs在细胞中具有关键的生理和病理作用。circRNAs可以通过结合和隔离microRNAs(miRNAs)来发挥其功能，也可以与RNA结合蛋白(RBPs)相互作用，甚至可以通过m6A依赖的转译来编码独特的肽[2]。在功能上，环状RNA参与许多生理过程，如维持干细胞多能性，控制细胞分化，调节细胞周期和凋亡，以及血管生成。然而，circRNA在PCa中的功能仍然知之甚少。

2022年12月，浙江大学医学院邵逸夫医院泌尿科薛定伟教授在Clinical and Translational Medicine发表文章Exosome-derived circTFDP2 promotes prostate cancer progression by preventing PARP1 from caspase-3-dependent cleavage。与PCa相关的circRNA—circTFDP2在PCa组织和细胞系中都上调。circTFDP2通过与PARP1相互作用并阻止其发生caspase-3依赖性的分裂，从而促进PCa细胞的增殖和转移。结果表明，RBPs的eIF4A3可调节circTFDP2的进展。此外，外泌体传递的circTFDP2在体内和体外都促进了PCa的肿瘤发生。本研究为前列腺癌提供了一个有前景的治疗靶点。

一、 circTFDP2在PCa中高表达

作者经过在50对PCa肿瘤和癌旁样本中筛选circRNA，发现hsa_circ_0008304蛋白来源于TFDP2，被命名为circTFDP2，在PCa样品中显著上调；circTFDP2表达与Gleason评分呈正相关；circTFDP2在转移灶的PCa患者中高表达。这些数据证实circTFDP2在前列腺癌中表达上调。Sanger测序确认circTFDP2的环化位点。背靠背验证其成环；放线菌素D验证其稳定性；核质分离和FISH鉴定其定位于细胞核和细胞质。这些数据证实了circTFDP2是一个环状RNA。

 

图1. circTFDP2的筛选过程及特性

 

二、 eIF4A3在PCa中调控circTFDP2的生物发生

先前的研究表明，几种RBP可以调节circRNA的产生。因此，作者使用circinteractome数据库(https://circinteractome.nia.nih.gov/)识别了circTFDP2侧翼区域的潜在RBP位点和circTFDP2侧翼区域的两个假定eIF4A3结合位点。RIP实验证明eIF4A3与circTFDP2的侧翼区域结合。因此，作者假设eIF4A3控制circTFDP2的生物基因。过表达eIF4A3增强了circTFDP2的表达，而下调eIF4A3则降低了其表达。接下来，作者在50对PCa组织中检测了eIF4A3的表达，结果表明，与正常组织相比，eIF4A3在PCa组织中高表达。总之，这些数据揭示了eIF4A3在PCa组织中调控circTFDP2的生成。
 

图2. eIF4A3在PCa中调控circTFDP2的生物发生

 

三、circTFDP2促进PCa细胞增殖，抑制其凋亡并促进PCa细胞迁移

为了探索circTFDP2在PCa中的具体作用，设计了circTFDP2特异性siRNAs和过表达质粒，并转染到PCa细胞中。敲低circTFDP2显著降低PCa细胞的增殖能力，而过表达circTFDP2则增强了PCa细胞的增殖能力，降低凋亡；而circTFDP2过表达结果相反。WB结果表明，敲低circTFDP2增加了cleaved caspase-3、PARP1和Bax的表达，降低了Bcl-2的表达；circTFDP2过表达结果相反。随后，作者通过建立裸鼠异种移植瘤模型，在体内检测了circTFDP2的致癌作用。结果表明，circTFDP2的下调显著抑制了体内肿瘤的生长；过表达circTFDP2有相反结果。随后，作者评估了circTFDP2在PCa细胞转移中的作用。Transwell检测显示，敲低circTFDP2显著降低了PCa细胞的侵袭和迁移能力，而过表达则相反。此外，裸鼠转移模型的结果与细胞结果一致。综上表示，circTFDP2促进PCa细胞增殖，抑制其凋亡并促进PCa细胞转移。

 

图3. circTFDP2促进PCa细胞增殖，抑制其凋亡并促进PCa细胞转移

 

四、 circTFDP2与PARP1相互作用并阻止其裂解

为了确定circTFDP2调控PCa进展的分子机制，我们首先分析了circRNADb数据库(http://reprod.njmu.edu.cn/cgibin/circrnadb/ circrnadb .php)。结果显示，circTFDP2不存在内部核糖体进入位点(IRES)或开放阅读框(ORF)区域，提示circTFDP2蛋白编码潜力较低。随后，由于circTFDP2同时位于细胞核和细胞质中，猜测circTFDP2可能具有miRNA海绵的功能。但AGO2-RIP实验表明，circTFDP2不能与AGO2蛋白相互作用，表明其不能作为miRNA海绵。

接下来，作者设计circTFDP2探针进行pulldown实验，发现有26个蛋白与circTFDP2特异性相互作用。在这些RBP中，PARP1由于可以抵抗前列腺癌症，被选为潜在的下游。PARP1-RIP实验证实了PARP1与circTFDP2之间的相互作用。FISH和IF检测确定了PARP1和circTFDP2之间的共定位。这些数据表明circTFDP2和PARP1在PCa细胞中形成了RNA蛋白复合物。

基于PARP1和circTFDP2之间的相互作用，作者研究了PARP1是否影响circTFDP2的表达。结果显示，circTFDP2的过表达或敲低都不能改变PARP1的表达和定位，这表明circTFDP2在转录后水平上没有调节PARP1的表达。

但是，由于circTFDP2与PARP1结合，而PARP1的DNA结合区被活跃的caspase-3识别并切割，作者假设circTFDP2影响这一过程。

WB实验显示，过表达circTFDP2会降低裂解PARP1的表达，而敲低circTFDP2则会增加裂解PARP1的表达；circTFDP2敲低的PCa细胞中增强的PARP1裂解被caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK阻断，表明circTFDP2阻止了PARP1依赖caspase-3的活性裂解。上述数据表明circTFDP2可以减弱PARP1的裂解。

 

图4. circTFDP2与PARP1相互作用并阻止其裂解

 

五、 PARP1促进前列腺癌细胞增殖和迁移

PARP1是PARP中最重要的成员之一，参与应激反应、DNA修复和细胞凋亡等多种细胞过程。由于circTFDP2与PARP1结合并阻止其分裂，作者检测了50对PCa肿瘤和癌旁中PARP1的表达。结果显示，PARP1在PCa组织中高度表达。使用TCGA数据库进行分析后，得到了相同的结果。CCK-8和transwell结果显示，敲低PARP1显著降低了PCa细胞的增殖和迁移能力，而反之则反。这些数据说明PARP1促进了PCa细胞的增殖和迁移。
 

图5. PARP1促进前列腺癌细胞增殖和迁移

 

六、circTFDP2通过PARP1调节前列腺癌细胞的DNA损伤

由于PARP1是单链断裂修复的重要分子，作者推测circTFDP2也可能通过阻止PARP1的切割来影响DNA损伤修复。WB和IF检测发现，PARP1过表达降低DNA损伤标志物yH2A.X表达，反之则反。而circTFDP2的过表达减轻了PCa细胞的DNA损伤，敲低circTFDP2的抑制加重了DNA损伤，表明circTFDP2参与了PCa细胞的DNA损伤。随后，CCK-8检测显示敲低circTFDP2抑制PCa细胞的增殖能力，反之则反。这些数据表明circTFDP2通过PARP1促进了PCa的进展。
 

图6. circTFDP2通过PARP1调节前列腺癌细胞的DNA损伤

 

七、 外泌体递送的circTFDP2促进前列腺癌进展

新兴的研究表明，癌细胞分泌的外泌体在调节细胞内通讯中起着至关重要的作用，从而参与各种生物学过程。从PCa细胞系的细胞培养基中收集外泌体并进行特征分析。qPT-PCR检测显示，细胞培养基中的外泌体比细胞质中的外泌体含有更多的circTFDP2。并且，circTFDP2在过表达的PCa细胞培养液中的外泌体中含量更高。为了探索外泌体递送的circTFDP2在PCa细胞进展中的作用，作者进行了CCK-8和transwell检测。结果表明，来自circTFDP2过表达细胞的外泌体增强了PCa细胞的增殖和转移。体内异种移植瘤模型结果和体外细胞结果一致。综上所述，外泌体递送的circTFDP2促进了前列腺癌的进展。
 

图7. 外泌体递送的circTFDP2促进前列腺癌进展

 

原文链接

https://doi.org/10.1002/ctm2.1156

参考文献

[1] Vlachaki A, Baltogiannis D, Batistatou A, et al. Screening for prostate cancer: moving forward in the molecular era. J BUON.2018;23:1242-1248.

[2] Singh S, Shyamal S, Panda AC. Detecting RNA–RNA interactome. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2022;13:e1715.

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9263 0 环状RNA联合m6A修饰和泛素化机制为中风患者带来福音 //www.xjpih.com/?p=9205 //www.xjpih.com/?p=9205#respond Fri, 10 Feb 2023 06:35:23 +0000 //www.xjpih.com/?p=9205
缺血性中风（Ischemic Stroke）作为一种常见的脑血管疾病，是我国成年人致残的首要原因。到目前为止，还缺乏促进中风康复和改善长期预后的治疗药物。中风后，缺血边缘区的血管修复可以通过改善血液供应、重构血管周围微环境、促进神经发生及突出形成等多方面促进神经功能恢复，被广泛认为是改善缺血性中风预后的关键修复措施。故研究中风后的血管修复的机制及治疗策略是一个迫切的研究领域，可以使大量患者受益。

环状RNA (circRNAs)是一种内源性非编码RNA分子，具有反向拼接和共价闭合连续环形成的圆形结构。越来越多的证据表明，细胞外囊泡(EV)穿过血脑屏障(BBB)并调控相关基因表达。而有研究发现，circRNA已被证明可以通过增强神经可塑性、抑制神经胶质反应性和外周免疫细胞浸润来改善中风后的运动功能恢复[1]。然而，circRNA是否促进缺血性中风后血管修复及其下游机制尚不清楚。

2023年1月，东南大学医学院姚红红教授课题组在Nature子刊Nature Communications（IF=17.694） 发表文章FTO-dependent m6A modification of Plpp3 in circSCMH1-regulated vascular repair and functional recovery following stroke。作者发现EV-circSCMH1能够有效促进缺血性中风模型小鼠与恒河猕猴脑血管修复，并且显著降低中风模型小鼠脑部N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰。机制上，circSCMH1促进脑血管内皮细胞FTO发生泛素化修饰，增加FTO向核内转移，导致血管发育相关基因-脂质磷酸磷酸酶3（lipid phosphate phosphatase 3，Plpp3）的m6A修饰降低，从而抑制了YTHDF2对Plpp3 mRNA的降解，导致Plpp3 mRNA与其编码蛋白LPP3在内皮细胞中的水平增加，促进血管修复。本研究从血管修复层面扩展了circSCMH1促进缺血性中风脑修复的机制，为治疗缺血性中风的新药研发提供了新思路和新靶点。

 

1、circSCHM1改善缺血性中风恢复期的血管修复

circSCMH1已被报道在中风后可显著增强神经元可塑性和功能恢复。作者为了研究circSCMH1在缺血性中风时血管修复中的潜在参与，通过EVs将circSCMH1传递到血栓形成(PT)的恒河猕猴的大脑。结果显示，circSCMH1可显著增加血管面积、长度及分支数量，增加BrdU阳性细胞以及与血管修复相关的内皮和周围细胞；小鼠模型结果与之一致。总之各项指标均表明，EV-circSCMH1可增加PT模型小鼠梗死周围区域circSCMH1水平，并促进血管修复。而针对于中风模型的血脑屏障完整性的重建，circSCMH1也有着积极的影响。

图1. CircSCHM1改善缺血性中风恢复期的血管修复

2、m6A修饰在中风患者和PT小鼠增加

m6A甲基化参与血管修复已被很多人报道[2]。作者收集了中风患者和非中风的体感觉皮层组织，发现中风患者组织中m6A甲基化水平显著升高，circSCMH1水平较低。作者检测了m6A相关甲基化酶和去甲基化酶的表达，包括METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5，结果发现中风患者组织中FTO水平明显降低，其余基因无明显差异；同样，在小鼠模型上的验证结果与之一致。

图2. m6A修饰在中风患者和PT小鼠增加

 

3、circSCMH1与FTO结合可减少m6 A修饰

前两部分结果指向：

（1）circSCMH1增强中风后血管修复；

（2）在中风和非中风患者中，circSCMH1与m6A水平之间存在负相关。接下来，作者解析了circSCMH1对中风后m6A甲基化影响的机制。EV-circSCMH1作用小鼠大脑后，PT模型诱导后梗死周围区域总RNA的m6A水平显著降低，而敲低circSCMH1的结果与之相反。

 

作者研究了circSCMH1对FTO表达的影响。然而，WB结果显示在中风模型中，EV-circSCMH1组和EV-Vector组的FTO水平无显著差异。这提示，circSCMH1可减弱m6A水平，但不影响中风后FTO水平。

先前的研究表明，FTO在细胞核和细胞质中表现出不同的底物偏好，m6A更可能是细胞核中初级聚腺苷酸RNA中的FTO底物29。因此，作者将眼光放到circSCMH1是否影响FTO转位到细胞核。我们首先研究了circSCMH1和FTO之间的相互作用。

通过RNA结合免疫沉淀试验，与阴性对照circHECW2和GAPDH相比，circSCMH1，而不是SCMH1，在ECs中显示出与FTO更强的亲和力。circSCMH1 pulldown实验显示，circSCMH1比circCon富集更多的FTO。作者进一步利用catRAPID算法预测出FTO中的三个区域与circSCMH1具有较高的互作能力，并设计突变和野生型载体进行了验证。综上提示，ECs中circSCMH1和FTO之间存在互作，并减少了m6 A修饰。

图3. circSCMH1与FTO结合可减少m6 A修饰

 

4、circSCMH1通过泛素化增加了FTO进入细胞核的易位

由于circSCMH1不影响PT小鼠FTO的水平，促使作者进一步检查FTO的核质再分配。结果发现，EV-circSCMH1给药后，PT小鼠FTO水平在细胞质中降低，而在细胞核中增加。这一发现在原发性小鼠大脑微血管ECs和bEnd.3细胞中得到证实。

有研究报道，泛素化可促进FTO从细胞质转移到细胞核，作者接下来研究了circSCMH1对FTO泛素化的潜在影响。circSCMH1过表达显著增加了赖氨酸63（Ub-K63）连接的泛素化水平。UBC13是Ub-K63的E2泛素偶联酶。RNA结合免疫沉淀实验显示，circSCMH1在bEnd中对UBC13具有更强的亲和力。

由于circRNAs被证明可以作为一个支架来增强泛素酶与其靶基因的结合[32]，接下来作者研究circSCMH1是否可以增强FTO与UBC13的结合。免疫共沉淀发现，circSCMH1能够促进FTO和UBC13相互作用。此外，作者发现，UBC13的敲低显著减弱了circSCMH1增强的FTO向细胞核的易位，为此作者做了调控模型如图k所示。综上所述，这些发现表明circSCMH1通过UBC13酶增加FTO的Ub-K63，并促进FTO从细胞质运输到细胞核。

图4. circSCMH1通过泛素化增加了FTO进入细胞核的易位

 

5、circSCMH1调控PT小鼠梗死周围皮层Plpp3 mRNA的m6A修饰

circSCMH1已被验证可降低PT中风模型中m6A甲基化水平，作者接下来探索下游甲基化基因。火山分布图显示，PT模型诱导后，m6A水平在279个转录本峰值区域显著升高，在898个转录本峰值区域显著降低，EV- circSCMH1转录本显著增加213个峰区，减少499个峰区。使用HOMER算法在EV-circSCMH1和EV-Vector治疗后的PT小鼠中鉴定出高度过度代表的共识序列GGACU motif，这表明PT模型m6A修饰的mRNA成功富集。

通过分析m6A峰的密度，我们发现在PT中风诱导后，m6A修饰水平在梗死周围区增加，EV-circSCMH1处理抑制了PT诱导的m6A修饰。PT模型诱导后，14个转录本的m6A峰值显著增加，EV-circSCMH1处理后抑制这14个转录本出现。两组比较中有8个重叠的转录本，这提示circSCMH1影响了PT后血管修复的靶转录本。

m6A通常在3-UTR中富集，作者进一步研究了m6A甲基化的变化是否影响这8种重叠转录本的水平。通过qPCR和WB检测发现，EV-circSCMH1上调血管生成相关基因Plpp3的表达。进一步分析了Plpp3的m6A修饰水平，结果显示，EV-circSCMH1减弱了Plpp3的m6 A修饰水平，而敲低FTO则可逆转这一结果。这表明m6A修饰介导了circSCMH1增强了Plpp3 mRNA的稳定性。

图5. m6A修饰介导了circSCMH1增强了Plpp3 mRNA的稳定性

 

6、FTO过表达促进PT小鼠血管及运动功能的恢复

FTO位于circSCMH1的下游。FTO过表达上调PT中风后Plpp3/LPP3的表达及其m6A甲基化，增加血管长度和分支数，增加BrdU+细胞数，脚部故障减少。这表明，在PT中风后，FTO会促进血管和运动功能的恢复。后续作者又使用了AAV载体构建，结果与此一致，脑中风后FTO的特异性表达有助于血管和运动功能的修复。

图6. FTO过表达促进PT小鼠血管修复

小结

综上所述：作者在恒河猴和小鼠上构建中风模型，发现circSCMH1显著促进中风后的血管修复。具体机制在于，circSCMH1促进脑血管内皮细胞FTO发生泛素化修饰，增加FTO向核内转移，导致Plpp3的m6A修饰降低，从而抑制了YTHDF2对Plpp3 mRNA的降解，导致Plpp3 mRNA与其编码蛋白LPP3的水平增加，促进血管修复。

EV-circSCMH1在缺血性中风后血管修复中的增强作用

 

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-36008-y

参考文献：

[1] Yang, L. et al. Extracellular vesicle-mediated delivery of circular RNASCMH1 promotes functional recovery in rodent and nonhuman primate ischemic stroke models. Circulation 142, 556–574 (2020).

[2] Yao, M. D. et al. Role of METTL3-dependent N(6)-methyladenosine mRNA modification in the promotion of angiogenesis. Mol. Ther.28,2191–2202 (2020).

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]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9205 0 Advanced Science | 外泌体circRNA可编码新型蛋白质诱导结直肠癌细胞自噬并产生奥沙利铂耐药性 //www.xjpih.com/?p=9188 //www.xjpih.com/?p=9188#respond Thu, 09 Feb 2023 06:43:36 +0000 //www.xjpih.com/?p=9188
CRC（结直肠癌）作为最常见的恶性肿瘤之一，是癌症导致死亡的第二大因素[1]。虽然临床上-针对CRC患者治疗的方案不断更新迭代，但是CRC患者的总体生存率仍旧很低。L-OHP (奥沙利铂)是一种抑制基因转录和DNA合成的第三代铂化合物，常用于CRC患者手术切除后的化疗方案中。然而，癌细胞最终形成的化学作用可通过多种机制阻碍L-OHP的有效性，包括药物吸收减少和药物失活等。因此，必须明确CRC细胞对L-OHP产生耐药性的精确分子机制，识别有效的生物标记物来分析L-OHP反应，并开发靶向治疗以减少耐药性。

越来越多的研究表示，外泌体中的非编码RNA和蛋白对参与肿瘤侵袭、增殖、免疫逃逸和耐药的靶细胞起作用，尤其是circRNA（环状RNA）。最近的一些研究已经报道了circRNA实际上可以编码蛋白质。并且外泌体富集的circRNA在CRC化疗耐药中的功能和潜在机制备受关注，并需要进一步研究。

近期，广东省人民医院胃肠外科主治医师李勇在Advanced Science上发表文章：A Novel Protein Encoded by Exosomal CircATG4B Induces Oxaliplatin Resistance in Colorectal Cancer by Promoting Autophagy。文章表示：L-OHP虽常用于结直肠癌手术切除后的化疗方案，但是其耐药性的出现会影响CRC患者的疗效。而circATG4B是L-OHP耐药发生的关键。机制在于，circATG4B可编码一种新的蛋白质（circATG4B-222aa）与TMED10互作，阻止TMED10与ATG4B结合，从而导致自噬增加，继而诱导L-OHP耐药。研究揭示了外泌体circATG4B参与了CRC细胞化疗敏感性的降低，为潜在的治疗CRCL-OHP 耐药靶点提供了新的理论基础。

1.L-OHP耐药CRC中ATG4B相关circRNA的分析

ATG4B在各种癌症中的自噬诱导功能，已被报道与化疗耐药有关[2]。因此，作者在circBase找到15个ATG4B，并从中发现circATG4B(hsa_circ_0007159)在L-OHP 耐药患者的CRC组织以及耐药CRC细胞系中明显上调。背靠背引物验证/R酶处理/FISH验证circATG4B成环/稳定/定位胞质。这些结果表明circATG4B稳定存在，并与CRC患者的L-OHP 反应密切相关。

图1. circATG4B的特性

 

2.来自外泌体的circATG4B诱导CRC细胞耐药性

以前的研究已经证明，circRNA可以包装成外泌体，并可以进行细胞间转移。因此，我们假设从L-OHP 耐药的CRC细胞分离出的外泌体circATG4B可转移到L-OHP 敏感细胞，导致细胞产生耐药性。为了验证这一假设，从L-OHP 耐药CRC细胞上清液中分离出的外泌体，电镜/NTA/WB观察其双层膜的结构/前体大小分布/外泌体标记物的表达，且circATG4B在外泌体中含量丰富；然后发现，该外泌体可侵染正常CRC细胞。此外，体外细胞实验+体内表示，外泌体circATG4B降低了CRC患者对L-OHP 的敏感性；而敲低circATG4B则有相反的结果。

图2.  外泌体的circATG4B诱导CRC细胞耐药性

 

3.外泌体circATG4B增强L-OHP 耐药过程中的自噬活性

根据以往的研究，自噬在药物耐药过程中起着重要作用。作者发现自噬诱导剂——雷帕霉素可诱导CRC细胞耐药，自噬抑制剂——3-甲基腺嘌呤增加CRC细胞耐药；L-OHP 会增加CRC细胞自噬水平，进而诱导CRC细胞耐药。而同时外泌体circATG4B可诱导CRC细胞L-OHP 耐药，作者推测自噬介导了该作用。过表达circATG4B增强CRC细胞耐药性，然而，3-甲基腺嘌呤治疗逆转了这一作用，表明circATG4B可以通过自噬诱导耐药。此外，透射电镜(TEM)分析显示，exo-si-NC预处理后自噬体数量增加，而exo-si-circATG4B预处理后自噬体数量显著减少(图3G)。进一步证实了外泌体circATG4B通过调节自噬诱导CRCL-OHP 耐药。

图3. 外泌体circATG4B促进细胞自噬

 

4.circATG4B编码一种新的蛋白-circATG4B-222aa诱导细胞L-OHP耐药

MicroRNA (miRNA)海绵作用是circRNA最常见的功能。然而，RIP结果显示circATG4B与AGO2无关，这表明circATG4B可能通过不同的机制发挥其功能。越来越多的证据表明，一些circRNA能够编码新的蛋白质。通过查阅circRNA Db发现，circATG4B有一个669nt的ORF，有可能编码222个氨基酸的蛋白质，并且其中有一段包含33个氨基酸的新序列。作者在ORF中发现534nt-672nt处有一个IRES，并用双荧光素酶法验证了circATG4B中IRES具有活性。随后，作者构造了四个不同的载体(阴性空载对照/带Flag标签载体/突变起始密码子+Flag标签阴性载体对照/线性阳性载体对照)，又研发了一种新的抗体（特异识别circATG4B-222aa），用qPCR和WB证实circATG4B-222aa能够被翻译出来。最后，通过SDS-PAGE分离转染了circATG4B细胞的总蛋白，然后将大小接近24kd的蛋白条带切除并提交质谱分析，发现了circATG4B的剪接位点处所形成的独特肽序列(IAELDPSIAVIGGGHKG)，表明circATG4B可以编码一种新的蛋白质。此外，在接受L-OHP 治疗的CRC患者中，circATG4B-222aa表达与不良预后呈正相关，这提示circATG4B-222aa可能是L-OHP 耐药细胞的预后标志物。

图4. circATG4B编码CircATG4B-222aa

 

作者通过将上述4种载体体外转染到CRC细胞中发现，仅转染circATG4B或circATG4B-222aa过表达载体后，自噬增加，CRC细胞耐药性增加；另外，作者又在体内小鼠中做皮下注射稳转四种载体细胞，结果同体外实验相同。这些结果表明，能够编码circATG4B-222aa的载体才可增加自噬水平，诱导细胞L-OHP 耐药。

图5.完整的circATG4B才可增加自噬水平，诱导细胞L-OHP耐药

 

5.circATG4B-222aa与TMED10蛋白互作，释放ATG4B

为了进一步探索circATG4B-222aa在自噬中的潜在机制。作者CO-IP/MS/IF检测circATG4B-222aa互作蛋白发现并验证了TMED10，并且二者定位于胞质。为了探索TMED10与circATG4B-222aa相互作用的区域，作者构建了一系列GFP标记的TMED10删除突变体。并通过Co-IP/WB实验验证，TMED10的TD和CD都是TMED10与circATG4B-222aa相互作用的必要条件。

通过与标记了circATG4B-222aa的截断突变体相互Co-IP分析，我们还确定了circATG4B-222aa与TMED10相互作用相关的区域。circATG4B-222aa (aa 1-111)和circATG4B-222aa (aa 112-222)都可以被TMED10拉下，表明无论是整段circATG4B-222aa还是前半段和后半段都可以与TMED10相互作用。但是在进一步的研究中，结果显示，只有全长的circATG4B-222aa可增加自噬过程。

由于circATG4B-222aa除了独特的氨基酸外，其大部分氨基酸序列与线性基因ATG4B相同，作者推测circATG4B-222aa可能通过结合TMED10，释放ATG4B。随后CO-IP结果发现，circATG4B-222aa过表达削弱了TMED10和ATG4B之间的相互作用，这表明circATG4B-222aa可结合TMED10，释放ATG4B。综上所述，这些发现表明circATG4B-222aa可能作为TMED10的诱饵，从而释放TMED10抑制的ATG4B。

图6.circATG4B-222aa与TMED10蛋白互作，释放ATG4B

 

6.circATG4B-222aa逆转TMED10诱导的L-OHP耐药CRC细胞的化疗敏感性

随后，作者评估了circATG4B-222aa和TMED10之间的相互作用在L-OHP 耐药细胞中的作用。体外实验发现，circATG4B-222aa可逆转了TMED10在耐药CRC细胞中诱导的凋亡和化疗敏感性的增加；体内实验发现，在植入过表达TMED10的细胞组中，肿瘤生长和体重均显著下降，而过表达circATG4B-222aa则逆转了这种抑瘤作用。总之，这些结果表明circATG4B-222aa可以拮抗TMED10作用，诱导细胞L-OHP耐药。

图7.circATG4B-222aa拮抗TMED10作用，诱导细胞L-OHP耐药

 

原文链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202204513

参考文献：

H. Sung, J. Ferlay, R. L. Siegel, M. Laversanne, I. Soerjomataram, A.Jemal, F. Bray, CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209.

A. Agrotis, R. Ketteler, Cells 2020, 9, 53.

转载请联系邮箱授权：circRNA@163.com

]]> //www.xjpih.com/?feed=rss2&p=9188 0 Cell Death Dis | circ_CEA抑制应激诱导的胃癌细胞凋亡的新机制 //www.xjpih.com/?p=9140 //www.xjpih.com/?p=9140#respond Sun, 29 Jan 2023 09:59:59 +0000 //www.xjpih.com/?p=9140
胃癌(GC)是最常见的癌症之一，全世界每年有100多万病例[1]。尽管其存活率在过去40年中显著增加，但GC仍然是2018年肿瘤死亡的第三大原因[2]。手术被认为是唯一根治胃癌的治疗策略，而化疗的加入可有效提高胃癌患者的存活率。然而，用于GC治疗的传统化疗药物，如阿霉素(Dox)，副作用严重，患者耐药性的产生也限制了其临床应用。因此，迫切需要研究胃癌的发病机制，为胃癌的诊断和治疗寻找新的靶点。

环状RNA(circRNA)是一组具有独特闭合环状结构的内源性RNA分子，在癌症的发生和发展中具有多种功能，例如作为microRNA(MiRNA)海绵的功能或作为蛋白质合成的模板。在之前的研究中，我们发现circAXIN1通过编码一种新的致癌蛋白AXIN1-295aa来促进GC的发展。此外，最近的研究报告了一些circRNA作为蛋白质支架来影响两个或更多蛋白质之间的相互作用。然而，circRNA作为蛋白质支架的确切机制以及circRNA的这种功能如何影响肿瘤的发生和GC的进展仍不清楚。

2022年9月27日，广东省基因组稳定性与疾病防治重点实验室Yin Peng在Cell Death and Disease上发表了一篇题为circ_CEA promotes the interaction between the p53 and cyclin-dependent kinases 1 as a scaffold to inhibit the apoptosis of gastric cancer的文章，在这篇文章中，作者揭示了circ_CEA通过作为蛋白质支架并与P53和CDK1蛋白相互作用，保护GC细胞免受应激诱导的凋亡。靶向circ_CEA与化疗药物联合治疗可增加肿瘤细胞的凋亡率，缩小肿瘤体积，减轻化疗药物的副作用。因此，针对GC治疗，靶向circ_CEA可能是一种新的策略。

 

1、数据库预测，获得目的circRNA

作者为了研究在GC中潜在的异常调节的circRNA，对5对GC和癌旁组织进行了高通量circRNA测序。共鉴定出478个调控异常的circRNA，表明这些circRNA可能参与了GC的发育。随后进一步分析了每对组织中circRNA的表达谱，以确定重叠的circRNA。circ_CEA(CircBase ID：HSA_CIRC_0051240)是唯一在所有五对GC组织中均显著上调的circRNA。因此，该circRNA被选中用于进一步研究。

 

2、circRNA表达研究

作者进一步检测了circ_CEA在GC组织中的表达水平。qPCR关于52例GC和相应的癌旁组织分析表明，circ_CEA在GC中显著上调。利用GSE152309的基因表达总集(GEO)数据库中的RNA-seq数据对circ_CEA和CEA之间的表达相关性进行了分析。结果显示，在10例胃组织中，circ_CEA与CEA呈正相关。综上所述，circ_CEA可能是影响GC总生存率的不良预后因素。此外，FISH结果显示，circ_CEA定位于细胞中的核和胞浆。

图1. circ_CEA在胃癌组织和细胞系中表达上调

 

3、circRNA表型研究

为了探讨circ_CEA在GC发展中的作用，作者构建circ_CEA的过表达和Simix敲低载体，在体外进行了功能分析。EDU分析显示，circ_CEA基因敲低显著抑制AGS细胞的增殖，而circ_CEA过表达促进增殖。此外，划痕实验和细胞迁移实验显示，敲低circ_CEA可显著减少细胞迁移，过表达circ_CEA则有相反的结果。此外，敲低circ_CEA可降低AGS细胞的克隆形成能力，而过表达circ_CEA亦有相反的结果。

为了研究circ_CEA在应激诱导的细胞凋亡中的作用，将过表达和敲低circ_CEA的AGS细胞置于血清饥饿中72小时，然后用Annexin V/PI染色通过流式细胞仪检测细胞凋亡。敲低circ_CEA可增加血清饥饿诱导的早期细胞凋亡，circ_CEA过表达则有相反的结果。

 

4、circ_CEA与P53和CDK1蛋白相互作用

接下来，作者研究了circ_CEA抑制应激诱导的GC细胞凋亡的机制。推测circ_CEA可能通过调控凋亡相关蛋白的表达或与这些蛋白相互作用而参与细胞凋亡。为了识别与circ_CEA相互作用的潜在蛋白质，我们进行了基于MS2/MS2-CP的RNA下拉试验。收集沉淀产物，进行蛋白质质谱分析。KEGG分析表明，这些蛋白质主要与内吞作用、剪接体、细胞周期和p53信号通路有关。

在这些蛋白中，与P53信号通路相关的P53和CDK1引起了人们的关注。P53在各种应激刺激下被激活，并通过诱导细胞凋亡而起到抑制肿瘤的作用。为了进一步证实circ_CEA是否与p53和CDK1蛋白相互作用，在293T和AGS细胞中进行了RIP检测。作者还研究了circ_CEA和FOXO_3之间的相互作用，FOXO_3是参与细胞应激反应和细胞凋亡的重要转录因子。在有或不有circ_CEA过表达的293T细胞中，抗P53抗体共沉淀了circ_CEA。在转染circ_CEA表达载体的293T细胞中，抗CDK1或FOXO_3抗体也可共沉淀。与293T细胞的研究结果一致，在转circ_CEA表达载体的AGS细胞中，抗P53、CDK1和FOXO_3抗体共沉淀了circ_CEA。进一步，利用生物素标记的针对circ_CEA连接位点的寡核苷酸探针，对293T细胞进行了CIRCCEA表达载体的RNA下拉检测。与对照探针相比，circ_CEA探针沉淀了更高水平的p-p53 ser315、p53、CDK1和FOX03蛋白。CDK1是Ser/Thr蛋白激酶家族中的一员，已被报道在Ser315处介导P53的磷酸化。进一步，用circ_CEA探针和抗P53抗体在AGS细胞中进行FISH分析，证实了circ_CEA和P53的共存。这些结果表明，circ_CEA与P53、CDK1和FOXO_3蛋白相互作用。

图2.circ_CEA抑制应激诱导GC细胞凋亡的机制探讨

 

5、circ_CEA促进CDK1介导的P53在Ser315位的磷酸化并抑制P53在胃癌中的活性

CDK1诱导的SER315处的P53磷酸化，降低了P53的稳定性并抑制了P53的功能。由于作者已经证明circ_CEA促进CDK1和P53蛋白之间的相互作用，接下来就研究了circ_CEA是否影响SER315处的P53磷酸化。用1.25μM的Dox处理siRNA转导的AGS细胞一段时间后，用Western blotting检测细胞中凋亡相关蛋白的表达。circ_CEA下调显著降低p-P53 ser315水平，但不影响总P53水平。

 

6、下调circ_CEA抑制体内肿瘤生长并促进细胞凋亡与胃癌肺转移的实验研究

为了研究circ_CEA对体内肿瘤生长的影响，我们将AGS细胞注射到BALB/c裸鼠体内，建立了皮下移植瘤模型。然后将这些小鼠随机分为4组：1.对照组、2.circ_CEA Simix敲低组、3.Dox组和4.Simix+Dox组。与对照组相比，circ_CEA Simix或Dox单独给药抑制肿瘤生长，而它们联合给药的抑制效果明显更明显。

qPCR分析证实，circ_CEA siRNA注射后，circ_CEA在体内的表达明显受到抑制。接下来，TUNEL分析显示，单独给予circ_CEA siRNA或Dox诱导皮下移植瘤中等程度的凋亡，而联合给予进一步促进凋亡。qPCR分析显示，circ_CEA Simix诱导P53促凋亡靶基因noxA、Puma、Fas、Bax和FOX03靶基因Bim显著上调。提示circ_CEA基因敲低可抑制肿瘤生长，促进细胞凋亡，其机制可能与体内调控P53靶基因表达有关。

与对照组相比，Dox或circ_CEA Simix单独给药显著减少了肺部转移灶，而联合给药对肺转移的抑制作用明显更大。此外，服用Dox或Dox+Simix的小鼠体重明显低于对照组或circ_CEA Simix组。对照组和circ_CEA Simix组小鼠体重无显著差异，表明circ_CEA Simix给药没有引起严重的副作用。在治疗癌症患者时，化疗毒性是一个主要问题。化疗药物与circ_CEA siRNA联合治疗可降低毒副作用，提高疗效。研究结果表明，circ_CEA下调可减少体内肺转移。联合应用circ_CEA、siRNA和Dox对肿瘤转移有协同抑制作用。

图3.circ_CEA抑制应激诱导GC细胞凋亡的机制

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41419-022-05254-1

参考文献：

[1]Rawla P, Barsouk A. Epidemiology of gastric cancer: global trends, risk factors and prevention. Prz Gastroenterol. 2019;14:26–38

[2]Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68:394–424.

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