circRNA的应用很大程度上受两个因素影响：序列长度，影响生产效率；翻译能力，影响表达效率。此外，较长的circRNA序列还容易形成长双链RNA（dsRNA）结构，可能激活PKR，引发强烈自身免疫。因此，工程化circRNA需要寻求一种适当的方案，使circRNA编码不同大小的ORF，同时保持合适的circRNA大小。
缩短序列逐渐成为circRNA序列优化焦点，这一般通过优化ORF和翻译起始元件实现。此前，美国密歇根大学团队通过编码更小的抗原及选择较小的IRES，最大限度缩短circRNA肿瘤疫苗的序列，增加稳定性、减少免疫刺激（PKR激活）作用，从而实现有效的肿瘤免疫治疗。
推荐阅读：Nature子刊 | 小环状RNA疫苗：更短的序列，更强的疗效
然而，限制ORF，缩小了circRNA翻译的蛋白质的选择范围，也就限制了基于编码circRNA的应用范围。因此，翻译起始元件成为重要的优化选择。目前用于circRNA翻译起始的最常见元件是IRES，特别是病毒的IRES，但这些序列往往较长（600-1000 nt），高度结构化，且翻译起始效率取决于细胞类型和物种。
近日，罗马大学Irene Bozzonih和Gaia Di Timoteo团队在预印本bioRxiv上发表论文：A Short 63-Nucleotide Element Promotes Efficient circRNA Translation。研究鉴定出仅63nt的短元件（13-mer + UTR3），其驱动circRNA翻译的效率与长IRES相当，且长度优势显著。该元件应用在不同细胞类型和ORF中均表现稳定，为circRNA疗法提供了更灵活的设计空间，有望推动大分子或复杂蛋白质的circRNA药物开发。
人IRES效果如何？
被验证的多种IRES中，EMCV和CVB3，分别来源于脑心肌炎病毒或柯萨奇病毒，是最常被描述和应用的两种。细胞mRNA也含有IRES元件，细胞结构化程度较低的IRES（二级结构会影响环化），有可能成为应用于circRNA的良好替代方案。
研究首先利用3×Flag-GFP ORF载体表达系统中比较了EMCV和CVB3与来自血管内皮生长因子和1型胶原诱导蛋白转录物（VCIP）的人IRES的效率。结果证明了VCIP IRES驱动GFP circRNA的翻译活性比EMCV和CVB3更有效。但较长的IRES显著增加二级结构形成，且长circRNA更容易产生切口，因此较长的IRES并不是最好的选择。
图1 A：cGFP构建体和相应的线性前体RNA的示意图；B：源自c-GFP翻译及其IRES突变体衍生物（VCIP、EMCV和CVB3）的相对蛋白表达水平。
一个63bp的元件兼备circRNA高翻译效率和短尺寸
翻译增强元件（TEE）是富含AUG三联体的5′ UTR序列，位于推定ORF的顺式上游，能够促进蛋白质产生。
一个非常短的序列（13nt，“13-mer”）是TEE中的特征性共同特征。为了进一步实现高翻译效率和小尺寸，研究采用TEE作为cGFP载体中的UTR，并选择不同的片段与起始密码子间隔开，以测试其驱动circRNA翻译的能力。结果显示13-glo间隔序列变体的翻译活性最高。
图2 A：VCIP、TEE及其衍生物的示意图；B：源自VCIP-cGFP翻译和所示cGFP突变体衍生物的相对蛋白质表达水平。
研究还考虑了翻译因子（如eIF4G、PABP）招募元件，以及内源性可翻译circRNA（circZNF609）的UTR序列作为间隔区序列，以进一步增强13-mer的性能。结果表明，circZNF609的UTR序列（UTR3）可驱动更高的蛋白表达水平，平均比13-glo高1.3倍，且比VCIP的性能更好。最后，研究得到一个非常短的翻译起始元件（63nt），由TEE中的13-mer和circZNF609的UTR3间隔区组成。该元件比常采用的较长IRES（600-800nt）更有效地驱动circRNA翻译，具有较高的生物学活性，且具有小尺寸的优势。
由13-mer起始的circRNA翻译也可以不影响circRNA大小的其它方法结合，例如滚动翻译、m7G帽的共价或非共价连接、RNA修饰（如m6A或N1甲基假尿苷），以释放circRNA作为治疗工具的潜力。
图2 A：13-glo及其间隔区变体的示意图；B：衍生自13-glo-cGFP及其指示的间隔区突变体衍生物的相对蛋白质表达水平。
应用于不同ORF和细胞类型不影响13-mer翻译效率
研究结果表明，13mer-UTR3的翻译起始效率不受ORF和circRNA表达的细胞类型的影响，但不排除进一步研究，设计组织特异性方式识别的circRNA翻译起始元件，以增强潜在circRNA药物的靶向性作用的可能性。
图3 A：源自c-ZNF609及其指定突变衍生物的相对蛋白质表达水平；B：源自c-GFP及其突变衍生物的相对蛋白质表达水平。
总结
基于circRNA疗法的优势已被众多研究验证，而circRNA药物的设计策略和生产工艺仍需进一步开发和完善。缩小环状RNA分子尺寸可有效降低合成成本、提升生产效率，并有望减少免疫原性风险。研究通过设计和验证得到63 nt的circRNA翻译起始元件，极大限度地缩短了circRNA序列长度，为编码序列释放更多空间，扩展了适合circRNA翻译蛋白范围，并拓宽了circRNA在疾病治疗中的应用前景。
作者提到，虽然该研究未使用高通量的筛选方法，但将来可能会使用高通量的方法，筛选更有效的元件，并进一步优化由13-mer驱动的circRNA翻译，如鉴定出能够进一步促进circRNA翻译的间隔区。
吉赛生物circRNA序列设计与优化平台，可提供翻译元件高通量筛选服务。利用核糖体新生肽链全长测序（Nanopore RNC-seq）可高通量筛选细胞中高活性的翻译元件，利用核糖体印迹测序（Ribo-seq）可进一步鉴定这些翻译元件的活性。结合多种高通量测序和生信分析技术，可以高效筛选出满足更短序列、更高活性、可驱动组织/细胞特异性翻译等不同需求的翻译元件，增加circRNA应用的更多可能性。
原文链接：
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.05.13.653105v2